Team:KIT-Kyoto/Notebook-week4

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August 29

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Time

9:00～

Member

岩城,古道,竹内,中村,臼井

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura,Usui

Purpose

DNA miniprep , agarose gel electrophoresis and density measurement of pSB6A1(K121013).[Furumichi]
PCR of hemH,ahpC,dps and OxyR.[Furumichi]
Confirm SufA and OxyR by agarose gel electrophoresis.[Iwaki]
DNA miniprep of pSB6A1(K121013).[Takeuchi]

(1)　pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定　[古道]

(2)　hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR　[古道]

(3)　SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認　[岩城]

(4)　pSB6A1(K121013)のmidiprep　[竹内]

Method

(1)　pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定

　前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに8割ほど移した

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心を行った

　↓溶出液を回収

　↓電気泳動を行い、同時に260nmの波長で吸光度測定を行った

(2)　hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を

　Mixしたプライマー(hemH,ahpC,dps,OxyR)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた

　↓下に示したプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR産物を電気泳動にかけた

テンプレートDNA	各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO₄	4μL
MilliQ	33μL
KOD-Plus-	1μL

(ahpC,OxyR)
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	62.2℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	保持
	30サイクル

(hemH,dps)
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	60℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	33sec	2min	保持
	30サイクル

(3)　SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認

　PCR産物5μlを使用して電気泳動を行った

　1%ゲルを用いて135V,15minの条件で泳動した

(4)　pSB6A1(K121013)のmidiprep

　カラム2本に各EQ1 10ml加え平衡化した

　前日から培養していたpSB6A1(K121013)100ml

　↓R3を4 ml加えてボルテックスした

　↓L7を4 ml加えて5 min放置した

　↓N3を4 ml加えた

　↓12,000rpm,10 min,25℃で遠心した

　↓上清を保存しそれをカラムの上に全量載せた

　↓カラムにW8を10 ml×2加え洗浄した

　↓カラムにE4を5 ml加えた

　↓チューブに2-プロパノールを3.5 ml加えた

　↓15,000rpm,30min,4℃で遠心した

　↓70 %エタノールを3 ml加えた

　↓15,000rpm,30 min,4 ℃で遠心した

　↓上清を捨て、37 ℃でインキュベート、乾燥させた

　↓TE50 μlに溶かし、溶け切るまで冷蔵した

Results

(1)

吸光度測定結果
	0.059
	0.055
	0.062
	0.059
	0.070
平均	0.061

この値から計算して、

DNA濃度：0.061×100×50＝3.05×10²(μg/ml)

電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された

(2)　PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した

(3)　SufAに関しては全てのサンプルでバンドが検出できた

　OxyRに関しては1,2のサンプルはバンドが検出できたが、3,4では検出できなかったので破棄した

(4)　冷蔵庫で保管した

August 30

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Time

9:00～

Member

岩城,福山,古道,吉村,足立

Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Yoshimura,Adachi

Purpose

DNA miniprep of pSB6A1(K121013),pSB6A1(K362008) and pSB6A1(K362012).And confirm by agarose gel electrophoresis.[Fukuyama,Adachi,Yoshimura]
Isolation of pSB6A1(K121013) fragments from agarose gel and ligation.[Yoshimura]
PCR of ahpC,OxyR,SodA and SufA.[Furumichi]
Concentrate by Phenol/chloroform and agarose gel electrophoresis of pSB6A1(K121013).[Furumichi]
Add H₂O₂ to pSB6A1(K362012) and observe by microscope.[Furumichi]

(1)　pSB6A1(K121013)

pSB6A1(K362008)

pSB6A1(K362012)

のアルカリミニプレップ,電気泳動によるバンド大きさの確認　[福山、足立、吉村]

(2)　pSB6A1(K121013)のゲル抽出・ライゲーション　[吉村]

(3)　ahpC,OxyR,SodA,SufAのPCR　[古道]

(4)　前日やり残したpSB6A1(K121013)のフェノールクロロホルム処理の続きと電気泳動　[古道]

(5)　培養したpSB6A1(K362012)に過酸化水素を加え顕鏡　[古道]

Method

(1)　アルカリミニプレップ,電気泳動によるバンド大きさの確認

　前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに８割ほど移した

　↓20℃、14500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓20℃、14500rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓20℃、14500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓20℃、14500rpmで1分間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓20℃、14500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓20℃、14500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓20℃、14500rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を回収

　↓右の表のように２種類の溶液を作成し、それぞれ10μlずつとって2μlの

　　loading dyeを加え、135Vで15分間電気泳動をした

	溶液1	溶液2
DNA溶液	10μl	10μl
M buffer	2μl	2μl
EcoRⅠ	0.5μl
SpeⅠ	0.5μl	1μl
MilliQ	7μl	7μl
全量	20μl	20μl

(2)　pSB6A1(K121013)のゲル抽出・ライゲーション

　(1)で制限酵素処理をしたものを2.5時間37℃でインキュベートした

　↓CIAPを3μl加え、25分間37℃でインキュベートした

　↓Orange Loading Dyeを加え、青ゲルにapplyした

　↓電気泳動した

　↓バンドのある部分のゲルを切り出し、エッペンに入れた

　↓エッペンに400μlの滅菌水を加え、60~80℃で6分間加熱した

　↓フェノールをエッペンの8割くらいまで加え、ボルテックスした

　↓4℃,14500rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し、回収した上清にフェノクロをエッペンの8割くらいまで加えた

　↓4℃,14500rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し、酢酸ナトリウムを50μl、2-プロパノールを800μl加えた

　↓4℃,14500rpmで10分間遠心した

　↓70%エタノールをエッペンの8割くらいまで加えた

　↓上清を捨て、遠心乾燥機にかけて乾燥させた

　↓滅菌水を10μl加え、Quick Ligase Reaction Bufferを10μl加えた

　↓リガーゼを1μl加え、5分間室温で放置した

　↓全量をコンピテントセルに加えた

　↓20分間氷冷

　↓45秒間43℃でヒートブロック

　↓5分間氷冷した

　↓SOC培地を900μl加えた

　↓37℃で20分間インキュベートした

　↓4℃,13000rpmで1分間遠心した

　↓培養液を少し捨て、量を減らしてピペッティングした

　↓LBプレートにまいた

　↓37℃でインキュベートした(overnight)

(3)　ahpC,OxyR,SodA,SufAのPCR

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を

　すでにMixしたプライマー(ahpC,OxyR,SufA,SodA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた

　↓下に示したプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR産物を電気泳動にかけ今後使えるかどうかチェックした

テンプレートDNA(DH5α)	各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO₄	4μL
MilliQ	33μL
KOD-Plus-	1μL

(ahpC, OxyR，SufA，SodA)
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	59.5℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	保持
	30サイクル

(4)　pSB6A1(K121013)のフェノールクロロホルム処理の続きと電気泳動

　↓遠心、4℃、14,000rpm、20min

　↓なぜか2層になってしまったので上清を回収し3MCH₃COONaを50µl加え混ぜた

　↓イソプロパノールを0.4ml加え混ぜ、4℃、14000rpm、10minで遠心した

　↓また2層になったので再び上清を回収して、4℃、14000rpm、10minで遠心した

　↓上清を捨て、沈殿に70％エタノール200µl加え、4℃、14000rpm、10minで遠心した

　↓乾燥させ、10µgRNase入りTEを30µl加えて冷蔵(4℃)保存した

　↓電気泳動をかけて今後使用できるものか確認した

(5)　培養したpSB6A1(K362012)に過酸化水素を加え顕鏡

　アンピシリン入りLB液体培地 2mlにpSB6A1(K362012)を白金耳でプレカルチャーし、

　　37℃で6時間振とう培養した

　↓培養したpSB6A1(K362012)500µlに400mM H₂O₂を5µlを加え、菌にストレスを与えた

　↓5min、室温、放置した

　↓10000rpmで1分間遠心した

　↓上清を捨て滅菌水で洗浄し再び10,000rpmで1分間遠心した

　↓上清を捨て、沈殿を用いて顕微鏡観察した

Results

(1)　pSB6A1(K121013)

　　　EcoRⅠ、SpeⅠで切断→バンドが3本見られた

　　　SpeⅠのみで切断→2本ずつバンドが見られた

pSB6A1(K362008)

　　　EcoRⅠ、SpeⅠで切断→4kbと1kbあたりにバンドが1本ずつ見られた

　　　SpeⅠのみで切断→4kb~5kbあたりのところに1本バンドが見られた

pSB6A1(K362012)

　　　EcoRⅠ、SpeⅠで切断→4kbと1kbあたりにバンドが1本ずつ見られた

　　　SpeⅠのみで切断→4kb~5kbあたりのところに1本バンドが見られた

(2)　翌日、コロニーが確認できた

(3)　電気泳動の結果PCR産物はすべてバンドが検出されていたため今後使用できるものと判断した

(4)　電気泳動の結果バンドは一切検出されなかった

(5)　過酸化水素を加えていないコントロールもともと光っていたため、

比過酸化水素を加えた方のGFPによる光の強度にあまり差が見られなかった

Consideration

(1)　pSB6A1(K121013)については、

カットチェックの結果、いずれも予想より1本ずつバンドが多い結果となった

このベクターは使わないほうが良いかもしれない

(4)　前日のフェノールクロロホルム処理の続きで遠心をかけて2層になってしまったのは、

前日の手順でフェノールを加え遠心した後に上清を回収し忘れたものではないか、

またイソプロパノールをきちんと加えたのかが疑わしい

August 31

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Time

9:00～

Member

岩城,福山,古道,吉村

Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Yoshimura

Purpose

DNA miniprep of pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430) and pSB1A2(I13507).And digestion by restriction enzymes.[Fukuyama]
Digestion of pSB6A1(K121013) by restriction enzymes.[Fukuyama]
PCR of hemH,dps and yaiA.[Furumichi]

(1)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ、カットチェック　[福山]

(2)　アルカリミニプレップを終えたpSB6A1(K121013)のカットチェック [福山]

(3)　hemH,dps,yaiAのPCR　[古道]

Method

(1)　アルカリミニプレップ、カットチェック

DH5α pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507)を
それぞれ1.5mlエッペンチューブにうつした
↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
↓上清を捨てた
↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
↓SolutionⅡを250μl加えた
↓SolutionⅢを350μl加えた
↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した
↓上清をカラムに入れた
↓20℃、14500rpmで30秒間遠心した
↓抽出液を捨てた
↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した
↓抽出液を捨てた
↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
↓抽出液を捨てた
↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
↓抽出液を捨てた
↓滅菌水をカラムに入れた
↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
↓溶出液を回収した
↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、
　それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥した
↓MilliQを30μl加えた

↓右の表1通りに調整した溶液を135Vで15分間電気泳動した

＜表1＞
DNA溶液	5μl
Buffer H	2μl
EcoRⅠ	0.75μl
PstⅠ	0.75μl
Milli Q	11.5μl
全量	20μl

(2)　アルカリミニプレップを終えたpSB6A1(K121013)のカットチェック

アルカリミニプレップを終えたpSB6A1(K121013)に
　　　1. ahpを挿入したもの
　　　2. sufAを挿入したもの
　　　3. プロモーターレスのもの
の溶液を右の表2のように、それぞれ4つないし3つ試料を作成し、
135Vで15分間電気泳動をした(試料4は3.のみ)

＜表2＞
	DNA溶液	BufferM	EcoRⅠ	XbaⅠ	PstⅠ	MilliQ
試料1	10μl	2μl	1μl			7μl
試料2	10μl	2μl		1μl		7μl
試料3	10μl	2μl			1μl	7μl
試料4	10μl					10μl

(3)　hemH,dps,yaiAのPCR

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を

　すでにMixしたプライマー(hemH,dps,yaiA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下表の組成で溶液を加えた

　↓それらを下表のプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR産物を電気泳動にかけ、今後使用できるものか確認した

＜試薬組成＞
テンプレートDNA(DH5α)	各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO₄	4μL
MilliQ	33μL
KOD-Plus-	1μL

＜PCRプログラム＞
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	60℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	38sec	2min	保持
	30サイクル

Results

(1)　3kb~4kbと、1kb周辺にバンドが確認できた

これらはそれぞれベクター、インサートの大きさと一致するので制限酵素処理は成功していると思われる

(2)　カットチェックについて以下にまとめた

1.について

　　　試料1　6kbあたりにバンドが1本見られた

　　　試料2　6kbあたりにバンドが1本見られた

　　　試料3　5kbあたりにバンドが1本見られた

　→GFPの発現があまり見られなかった大腸菌と、

　　GFPの発現が顕著に見られた大腸菌の両方で確認した結果、

　　前者は試料1にはバンドが確認できなかった　　

　→また、なぜ制限酵素が違うとバンドの大きさが違ったのかも分からなかった

2.について

　　　試料1 6kbあたりにバンドが1本見られた

　　　試料2 6kbあたりにバンドが1本見られた

　　　試料3 6kbあたりにバンドが1本見られた

3.について

　　　試料1　　5kbと3kbあたりにバンドが1本ずつ見られた

　　　試料2　　5kbと3kbあたりにバンドが1本ずつ見られた

　　　試料3　　5kbと3kbあたりにバンドが1本ずつ見られた

　　　試料4　　5kbと3kbあたりにバンドが1本ずつ見られた

　→3.のプラスミドは理想通りの結果が得られなかったので、破棄することにした

(3)　PCR産物の電気泳動の結果、すべてバンドが検出されたので今後使用するものとする

ただし、hemHのバンドは他のものに対し薄かった

September 1

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Time

9:00～

Member

岩城、古道

Iwaki,Furumichi

Purpose

DNA miniprep of pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507) and pSB6A1(K121013).[Furumichi]
Digestion pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507) and pSB6A1(K121013) of by restriction enzymes.[Furumichi]

(1)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(E0430)、

pSB1A2(I13507)、pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、DNA濃度測定　[古道]

(2)　アルカリミニプレップ済の

pSB1A2(E0420)9/1付け、pSB1A2(E0430)9/1付け、

pSB1A2(I13507)9/1付け、pSB6A1(K121013)の制限酵素処理　[古道]

Method

(1)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(E0430)、

pSB1A2(I13507)、pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、DNA濃度測定

　培養済のpSB1A2(E0420)、pSB1A2(E0430)、

　pSB1A2(I13507)、pSB6A1(K121013)を1.5mlエッペンに集菌した

　↓菌体を氷令したSoltionⅠ100µlに懸濁しvortexした

　↓SoltionⅡ200µl加え混合し氷上に5分放置した

　↓SoltionⅢ150µl加え混合し氷上に5分放置した

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上清を回収しφOH/CIAAを200µl加え14000rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収しCIAA を200µl加え14000rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し400µlのイソプロパノールを加え混ぜた

　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した

　↓上澄みを捨て70％エタノールを200µl加えvortexした

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上澄みを捨てて5分間、37℃インキュベートで乾燥させた

　↓RNase入りTE(10µg/ml)30µlを加え37℃で30分間インキュベートした

　↓吸光度測定をした

　↓8/31にアルカリミニプレップ処理をしたpSB1A2(E0420)、

　　pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)も吸光度測定を行った

(2)　アルカリミニプレップ済の

pSB1A2(E0420)9/1付け、pSB1A2(E0430)9/1付け、

pSB1A2(I13507)9/1付け、pSB6A1(K121013)の制限酵素処理

　下の組成の通りに1.5mlエッペンに分注した

	pSB6A1 (BBa_K121013)	pSB1A2 (BBa_E0420:CFP)	pSB1A2 (BBa_I13507:RFP)	pSB1A2 (BBa_E0430:YFP)
DNA	80µl	70µl	110µl	90µl
H₂O	9.4µl	19.4µl	24.4µl	44.4µl
H buffer	10µl	10µl	15µl	15µl
EcoRⅠ	0.3µl	0.3µl	0.3µl	0.3µl
PstⅠ	0.3µl	0.3µl	0.3µl	0.3µl
total	100µl	100µl	150µl	150µl

　↓37℃で一晩インキュベートした

Results

(1)　吸光度測定結果

8/31付け pSB1A2(E0420) (100倍希釈)
	1.176
	1.120
	1.104
	1.089
	1.088
平均	1.1154
濃度：5.58×10³(µg/ml)

8/31付け pSB1A2(BBa_E0430:YFP) (100倍希釈)
	1.322
	1.310
	1.309
	1.292
	1.286
平均	1.3038
濃度：6.51×10³(µg/ml)

8/31付け pSB1A2(I13507) (100倍希釈)
	1.134
	1.114
	1.110
	1.102
	1.104
平均	1.1128
濃度：5.56×10³(µg/ml)

9/1付け pSB1A2(BBa_E0420:CFP) (100倍希釈)
	1.318
	1.309
	1.316
	1.320
	1.327
平均	1.318
濃度：6.59×10³(µg/ml)

9/1付け pSB1A2(E0430) (100倍希釈)
	1.567
	1.538
	1.528
	1.516
	1.490
平均	1.5278
濃度：7.64×10³(µg/ml)

9/1付け pSB1A2(I13507) (100倍希釈)
	1.193
	1.169
	1.196
	1.188
	1.189
平均	1.187
濃度：5.935×10³(µg/ml)

pSB6A1(K121013) (100倍希釈)
	1.193
	1.390
	1.378
	1.362
	1.336
平均	1.3712
濃度：6.91×10³(µg/ml)

(2)　一晩、制限酵素処理した後、DNA抽出を行う

September 2

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Time

9:00～

Member

岩城,福山,古道,足立

Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Adachi

Purpose

Concentration of pSB6A1(K121013) and digestion by restriction enzymes.[Fukuyama]
Isolation of promoter DNA fragments from agarose gel.[Fukuyama]
Concentrate promoter DNA by Phenol/chloroform.[Adachi]
Isolation of pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430) and pSB1A2(I13507) fragments from agarose gel.[Furumichi]

(1)　pSB6A1(K121013)の濃縮と制限酵素処理　[福山]

(2)　プロモーターDNAのみを得る　[福山]

(3)　プロモーターDNAを精製する　[足立]

(4)　制限酵素処理済のpSB6A1(K121013)、pSB1A2(E0420)

pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のDNA抽出をする　[古道]

Method

(1)　pSB6A1(K121013)の濃縮と制限酵素処理

　pSB6A1(K121013)の2試料(試料A,B)のうち、

　試料Aの一部を右表1,2の通りに制限酵素処理して135Vで15分間電気泳動した

　↓試料A,Bに酢酸ナトリウム200μL、イソプロパノール400μL(等量)を加えた

　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した

　↓70%EtOHを200μL加えた

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓遠心乾燥を行った

　↓これにMilliQ30μLを加えた

　↓表3の通りに各試薬を加えて37℃で3時間ほどインキュベートした

　　　　※試料Bはここまで(一晩インキュベート)

　↓CIAPを3μl加えて37℃で30分間インキュベートした　

　↓3-colors Indicatorを8μl加え、50Vで１時間電気泳動した

表1
DNA	10μl
Buffer H	2μl
EcoRⅠ	0.3μl
PstⅠ	0.3μl
MilliQ	7.4μl
total	20μl

表2
DNA	10μl
MilliQ	10μl
total	20μl

表3
DNA溶液	30μl
EcoRⅠ	0.5μl
PstⅠ	0.5μl
H Buffer	4μl
MilliQ	5μl
total	40μl

(2)　プロモーター(hemH,AcrAB,yaiA,SodA)のゲル抽出

　Orange Loading Dyeを加え、青ゲルにapplyした

　↓1kbpマーカーとともに50Vで1時間電気泳動した

　↓バンドのある部分のゲルを切り出し、エッペンに入れた

　↓ゲルの3倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベートし、2,3分毎に振り混ぜた

　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを370μL加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓溶出液を新しいエッペンチューブにうつした　　　

(3)　プロモーター(dps,SodA,yaiA,AcrAB,hemH,OxyR)のフェノクロ処理

＜材料＞

　PCR済みのプロモーター(dps,SodA,yaiA,AcrAB,hemH,OxyR)

　H2O

　フェノールクロロホルム

　2-プロパノール

　70%ethanol

＜方法＞

　PCR後のDNAを以下の量エッペンに取り、全量600μlになるようH2Oを加え調節した

　hemH,OxyRについては、前回DNA量200μlでGEL抽出を行なおうとした際バンドが薄く抽出できなかったため、

　他のプロモーターのDNA量よりも増やした

	dps	SodA	yaiA	AcrAB	hemH	OxyR
DNA(μl)	200	200	200	200	400	400
H₂O(μl)	400	400	400	400	200	200
計(μl)	600

　↓CH3COONa 50μlを各エッペンに加えた。

　↓フェノールクロロホルムをエッペンの8割ぐらいまで入れた

　↓2，3回振ったのち、白濁するまでvoltexをした

　↓cfg,14500rpm,5min,Tr(室温)

　↓上清を回収したのち、2-プロパノールをエッペンの8割ぐらいまで加えた

　↓cfg,14500rpm,10min,4℃

　↓上清を捨て、70%ethanolをエッペンの8割ぐらいまで加えた

　↓cfg,14500rpm,3min,4℃

　↓上清を捨てた

　↓遠心乾燥機でペレットが乾燥するまで待った

　↓RNase in TE(10mg/ml)を各エッペンに30μlずつ加えた

(4)　制限酵素処理済のpSB6A1(K121013)、pSB1A2(E0420)、

pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のDNA抽出

　一晩制限酵素処理したpSB6A1(K121013)にCIAPを3µl加え、37℃で30分間インキュベートした

　↓アルカリフォスファターゼ処理し終えたpSB6A1(K121013)とpSB1A2(E0420)、

　　pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)を1％青ゲルに流し135Vで15分間電気泳動した

　↓バンドが検出されゲルの切り出しができそうなpSB1A2(E0420)

　　pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のゲルを切り出した

　↓切りだしたゲルの重さを事前に量った

　↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート

　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓保存した

Results

(1)　カットチェックは問題なかったが、ゲル抽出のための電気泳動後、

2本みえるはずのバンドが何故か4本確認できた。おかしな結果がでた試料Aは廃棄することにした

(2)　本当は最後は37μlのMilliQを加えるはずが、誤って370μl加えてしまった

今日は吸光度を計測しなかったので、濃度はまだ分かっていない

(3)　各プロモーターDNAを精製することができた

(4)　電気泳動の結果、pSB6A1(K121013)にはバンドが現れずまたは薄すぎて見えなかったのか、

ゲル抽出をすることができなかった。そのためpSB6A1(K121013)の濃縮を行う必要があった

その濃縮を実験内容(1)で行った

September 3

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Time

9:00～

Member

福山,足立,吉村

Fukuyama,Adachi,Yoshimura

Purpose

DNA miniprep of pSB6A1(K121013) and digestion by restriction enzymes.[Yoshimura]
pSB6A1(K121013) digestion by restriction enzymes.[Adachi]
Agarose gel electrophoresis of pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507) and pSB6A1(K121013).[Fukuyama]

(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理　[吉村]

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理　[足立]

(3)　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),

pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)の電気泳動　[福山]

Method

(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理

　前日から培養していた大腸菌を1.5mlエッペンにうつした

　↓15,000rpm,25℃で1分間遠心した（集菌）

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μl加え、ピペッティング、ボルテックスして沈殿を完全に溶かした

　↓SolutionⅡを250μl加え、4~5回上下にして混ぜた(膜溶解)

　↓1分間放置した

　↓SolutionⅢを350μl加えた(タンパク質析出)

　↓13,000rpm,25℃で5分間遠心した

　↓上清をカラムに流した

　↓13,000rpm,25℃で30秒間カラムごと遠心した

　↓溶出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μl加えた

　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した

　↓溶出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μl加えた

　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した

　↓溶出液を捨て、もう一度13,000rpm,25℃で30秒間遠心した

　↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた

　↓滅菌水を100μl加えた(DNA溶出)

　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心し、プラスミドを濃縮した

　↓制限酵素処理を行うために吸光度を測った

　　(値を右表1に示した)

　↓右表に示した組成で制限酵素処理を行った

　↓37℃で40分間インキュベートした

　↓135Vで15分間電気泳動してカットチェックをおこなった

表1: 吸光度
×1/100 pSB6A1
1回目	0.041
2回目	0.047
3回目	0.047
4回目	0.050
5回目	0.045
Ave.	0.046

表2: 試薬組成
DNA	10μl
EcoRⅠ	0.3μl
PstⅠ	0.3μl
M Buffer	6μl
Milli Q	7.4μl
Total	20μl

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理

　pSB6A1(BBa K121013)の制限酵素処理をするために吸光計によりOD₂₆₀で濁度を測定した

　濁度の測定結果を右表3に示す

　　　表3: pSB6A1(BBa K121013)の100倍希釈したときの濁度

　表3より、DNA濃度：0.0108×100×50＝0.54×10²(μg/ml)と分かった

　これは制限酵素処理するのに濃度が低すぎるため、翌日濃縮することにした

表3: 濁度
×1/100 pSB6A1
1回目	0.007
2回目	0.015
3回目	0.008
4回目	0.012
5回目	0.012
Ave.	0.0108

(3)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)の電気泳動

　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)を

　それぞれ5μlとって1μlのloading dyeを加えた

　↓1％アがロースゲルを用いて、1kbp ladderとともに100Vで3時間電気泳動した

Results

(1)　バンドが出なかった

(2)　pSB6A1(K121013)のDNA濃度が薄すぎたため、制限酵素処理ができなかった

(3)　pSB1A2(E0420)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　

pSB1A2(E0430)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　

pSB1A2(I13507)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　

pSB6A1(K121013)→バンドは確認できなかった

Consideration

(1)　試薬に問題ありか？

(3)　pSB6A1(K121013)→非常に薄いDNA溶液であると思われる

September 4

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Time

9:00～

Member

岩城、福山

Iwaki,Fukuyama

Purpose

DNA miniprep of pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), and pSB6A1(E0430).[Fukuyama]
DNA miniprep of pSB6A1(K121013).[Iwaki]

(1)　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ　[福山]

(2)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出　[岩城]

Method

(1)　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ

　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓このうち溶出液を1μlとって100倍希釈して吸光度を測定した

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓酢酸ナトリウム50 μlとフェノクロ800 μlを加えた

　↓25℃、14,500rpmで5分遠心した

　↓上清を回収した

　↓2-プロパノールをチューブの8割程度まで加えた

　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した

　↓上清を除いた

　↓70 %エタノールをチューブの8割程度まで加えた

　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した

　↓上清を除いた

　↓乾燥した

　↓30 μlの水に溶かした

　↓1kb ladderとともに、各試料から一部とって電気泳動した

(2)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出

　前日から10本の試験管（3 mlのLB培地(+Amp)）で37℃で一晩培養した

　↓チューブ10本にうつした

　↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓新しいチューブに移すのを忘れたため、これらを2本にまとめた

　↓酢酸ナトリウム50 μlとフェノクロ800 μlを加えた

　↓25℃、14,500rpmで5分遠心した

　↓上清を回収した

　↓2-プロパノールをチューブの8割程度まで加えた

　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した

　↓上清を除いた

　↓70 %エタノールをチューブの8割程度まで加えた

　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した

　↓上清を除いた

　↓乾燥した

　↓100 μlの水に溶かした

　↓1 %ゲルを用いて、100 Vで20分間電気泳動した

　↓35分間EtBrで染色した

　↓紫外線を照射し写真を撮影した

　↓100倍希釈して吸光度を計測した

Results

(1)　吸光度測定(260nm)の結果を下表1に示した

　　　表1:100倍希釈したもの

表1
	CFP-1	CFP-2	RFP-1	RFP-2	YFP-1	YFP-2
1回目	-0.024	-0.018	-0.024	-0.026	-0.011	-0.013
2回目	-0.022	-0.025	-0.02	-0.015	-0.009	-0.014
3回目	-0.016	-0.021	-0.027	-0.021	-0.016	-0.019
4回目	-0.023	-0.025	-0.021	-0.016	-0.016	-0.014
5回目	-0.024	-0.019	-0.029	-0.023	-0.012	-0.011
平均	-0.0218	-0.0216	-0.0242	-0.0202	-0.0128	-0.0142

いずれの試料もほぼDNAはないに等しかった

また、濃縮後に行った電気泳動でも6つの試料全て濃度が低かったようで、バンドは確認できなかった

(2)　電気泳動に関して

プラスミド溶液を5 μlと10 μl使用し電気泳動した

どちらでも薄いバンドしか確認できなかった

吸光度に関して

100倍希釈して5回計測した

1.531

-0.403

-0.217

-0.254

-0.192

Consideration

(1)　いずれの試料も、DNA濃度は、ないといえるほど非常に低いので、今後の実験には使えないと考えられる

(2)　電気泳動の結果と吸光度から、抽出したプラスミドの濃度は薄いと考えられる

ゲル抽出に使用してもおそらくバンドが出ないと予想される

抽出の過程でカラムを新しいチューブに乗せ換えるのを忘れたことによりロスが多かったと考えられる。

後日再度プラスミド抽出する必要がある

今回のサンプルは純度には問題がないので、後日抽出したサンプルと合わせて使用すればゲル抽出に使用可能である