Team:KIT-Kyoto/Notebook-week7

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Week1
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08-11-201008-12-201008-13-201008-14-2010
Week208-15-201008-16-201008-17-201008-18-201008-19-201008-20-201008-21-2010
Week308-22-201008-23-201008-24-201008-25-201008-26-201008-27-201008-28-2010
Week408-29-201008-30-201008-31-201009-01-201009-02-201009-03-201009-04-2010
Week509-05-201009-06-201009-07-201009-08-201009-09-201009-10-201009-11-2010
Week609-12-201009-13-201009-14-201009-15-201009-16-201009-17-201009-18-2010
Week709-19-201009-20-201009-21-201009-22-201009-23-201009-24-201009-25-2010
Week809-26-201009-27-201009-28-201009-29-201009-30-201010-01-201010-02-2010
Week910-03-201010-04-201010-05-201010-06-201010-07-201010-08-201010-09-2010
Week1010-10-201010-11-201010-12-201010-13-2010
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September 19

Time

10：00～

Member

古道、竹内、臼井
Furumichi,Takeuchi,Usui

Purpose

  1. Measurement of promoter activity of yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 and promoterless pSB6A1.[Furumichi]
  2. Isolation of AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA and SodA from agarose gel and DNA ligation amd transform into the competent cells. [Usui]
  3. Picking up single colony of dps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3.[Furumichi]
  4. Cultivate of dps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3.[Furumichi]
  5. Cultivate of AhpC GFP on pSB6A1、Suf GFP on pSB6A1、SodA GFP on pSB6A1、yaiA GFP on pSB6A1,promoterless GFP on pSB6A1.[Furumichi]
(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定　[古道]
(2)　AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA,SodAの電気泳動
→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション　[臼井]
(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3
のコロニーをピックアップ、ストリーク　[古道]
(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養　[古道]
(5)　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1
プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養　[古道]

Method

(1)　yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定
＜材料＞
　　培養済みyaiA on pSB6A1
　　　　　　SufA on pSB6A1
　　　　　　ahpC on pSB6A1
　　　　　　プロモーターレスpSB6A1
　　各濃度のH2O2(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)
　　1xPBS
＜方法＞
　培養済yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1を
　アンピシリン入りLB液体培地を用いて20倍希釈した
　↓吸光度測定した
　↓その20倍希釈yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1 500μlに
　　各濃度のH2O2(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)0.5μlを加え混ぜた
　↓37℃、30min、振とう培養した
　↓4℃、14,000rpm、3minで遠心し集菌し、上清を除いた
　↓1xPBSを150μlずつ加えボルテックスした
　↓蛍光数値の測定をした
(2)　電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション
　11日(14)(15)(16)と手順は同じである
　変更点のみ以下に示す
　ゲル抽出後の濃度より
　　　　X=ベクター(pSB1C3)の量
　　　　Y=プロモーターの量　　　とし、
　ベクターの濃度(94ng/μL)xX　：　プロモーターの濃度xY　＝　1：2
　ベクターの長さ(2072)　　　　　　　プロモーターの長さ
　よりライゲーションの濃度を決定した
表1: ライゲーションの試薬組成
AcrAB 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 1.9μL
dps 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 1.9μL
oxyR 0.8μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 2.0μL
ahpC 1.3μL + pSB1C3 6.5μL + H2O 2.2μL
sufA 0.7μL + pSB1C3 7.0μL + H2O 2.3μL
　これらに2xligation Bufferを10μL加え全量20μLとした
(3)　DH5αにトランスフォーメーションしたベクターのコロニーをピックアップ、ストリーク
　DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3の
　コロニーをピックアップしクロラムフェニコール入りLB寒天培地にストリークし3時間程37℃インキュベートした
(4)　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養
　(3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を白金耳でとり、
　クロラムフェニコール入り3mlLB液体培地に加え、37℃、一晩、インキュベートした
(5)　AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養
　AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1
　プロモーターレス GFP onPSB6A1のストリークしてあるマスタープレートから白金耳でひっかいて、
　アンピシリン入りLB液体培地3mlに加えた
　↓5時間程、37℃、振とう培養し冷蔵保存した

Results

(1)
表2: 吸光度測定結果
1/20yaiASufAahpCプロモーターレスpSB6A1
0.3920.4200.4600.430
0.3940.4300.4600.454
0.4600.4300.4580.452
表3: 蛍光数値測定結果
yaiA
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM0.16380.16320.1647
100μM0.14590.14060.1422
10μM0.16110.16520.1605
1μM0.17270.17810.1789
100nM0.15780.16350.1579
10nM0.17390.17950.1751
1nM0.15940.16250.1598
H2O2less0.16950.16950.1675
SufA
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM2.2612.3182.337
100μM1.5521.581.568
10μM1.3451.371.37
1μM1.3371.3431.338
100nM1.3841.4041.409
10nM1.2761.2011.284
1nM1.3061.2881.276
H2O2less1.2681.2651.272
ahpC
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM12.2712.6413.2
100μM7.3227.4327.579
10μM5.9816.0366.112
1μM4.8514.8994.974
100nM4.1814.1844.256
10nM4.5594.6334.689
1nM4.4364.3814.466
H2O2less4.7884.8264.931
プロモーターレスpSB6A1
H2O2濃度1回目2回目3回目
1mM0.36940.37750.3734
100μM0.41090.4070.3898
10μM0.29030.29490.2925
1μM0.26920.27480.2714
100nM0.34570.34140.3443
10nM0.27850.28540.2838
1nM0.32170.3330.3311
H2O2less0.21710.22070.2268
(2)電気泳動結果: SodAのみUVの照射によるインサートの制限酵素処理の確認でインサートが見当たらなかった
これはおそらく制限酵素処理がきちんとなされていなかったため
ゲル抽出後の吸光度
AcrAB
1回目0.024
2回目0.017
3回目0.005
4回目0.017
5回目0.005
Ave0.0136
濃度13.6ng/μL
dps
1回目0.018
2回目0.016
3回目0.017
4回目0.017
5回目0.017
Ave0.015
濃度16.6ng/μL
oxyR
1回目0.019
2回目0.018
3回目0.019
4回目0.019
5回目0.019
Ave0.0188
濃度18.8ng/μL
ahpC
1回目0.036
2回目0.035
3回目0.035
4回目0.035
5回目0.036
Ave0.035
濃度35.0ng/μL
sufA
1回目0.014
2回目0.018
3回目0.018
4回目0.018
5回目0.017
Ave0.017
濃度17.0ng/μL
(3)　コロニーをピックアップする時点で明らかにRFPが乗っているものがどのプレートにも現れていた
37℃インキュベート後の結果より、ストリークはうまくできていたがRFPで色づいたであろうコロニーを
ピックアップしストリークしたものも赤く色づいてた。これは前回の制限酵素処理が不十分だったためと考えられる
(4)　(3)でストリークしたもので赤くないものを選び培養した
次回この培養させた
AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1を集菌する
(5)　次回、集菌作業を行う

September 20

Time

10：00～

Member

竹内、革島、中村
Takeuchi,Kawashima,Nakamura

Purpose

  1. Cultivate of pSB1C3 and DNA miniprep of this and digestion by restriction enzymes.[Kawashima]
  2. GFP fluorescent strength measurement of ahpC and sufA.[Nakamura]
(1)　提出用ベクターpSB1C3の培養→ミニプレ(カラム不使用)→制限酵素処理　[革島]
(2)　ahpC及びsufAのGFP蛍光強度測定　[中村]

Method

(1)　提出用ベクターpSB1C3の培養→ミニプレ(カラム不使用)→制限酵素処理
＊培養
　白金耳によるLB培地3mL(＋クロラムフェニコール)へのpSB1C3の培養
＊ミニプレ
　9/15カラム不使用のミニプレ参照
　最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした
＊制限酵素処理
　EcoRⅠ、pstⅠを3μL用い、Total　50μLで処理した
(2)　ahpC及びsufAのGFP蛍光強度測定
　Overnightで培養したahpC及びsufA各2本のO.D.600を測定した
　↓適正であったahpC1本とsufA2本をLB培地(+amp)でO.D.600が0.5になるように希釈した
　↓O.D.600が0.4～0.6の間にあることを確認し、500μLずつエッペンに分注した(各5本)
　↓終濃度が100nM、50nM、10nM、5nM、1nMとなるように過酸化水素を加えた
　↓37℃、30minインキュベート
　↓cfg.　4℃　10,000rpm　1min
　↓アスピレーターで上清を除いた
　↓ペレットをPBS150μLに溶かし、内100μLを蛍光強度測定に用いた

　　　　＊過酸化水素付加後の時間を20minで2回目を行った

Results

(1)
＊培養
　　残り7本はアートに使用する
＊ミニプレ
表1: ミニプレ結果
pSB1C3 1pSB1C3 2
OD2600.5810.592
DNA濃度14525ng/μL14800ng/μL
全量31μL33μL
＊制限酵素処理
　　なし
(2)
表2: ahpC、sufAの蛍光強度(1回目)
ahpC 2sufA 1sufA 2
100nM11.941.3841.151
50nM11.571.3481.182
10nM12.221.3261.113
5nM12.131.3711.210
1nM12.611.3191.153
表3: ahpC、sufAの蛍光強度(2回目)
ahpC 2sufA 1sufA 2
100nM16.261.3841.081
50nM14.751.2511.185
10nM13.951.3951.352
5nM16.821.2951.211
1nM13.901.3221.174

Consideration

(1)　問題なく結果を出せた
(2)　ahpC、sufA共に前回の実験で見られた、10nM前後の濃度で蛍光強度が大きくなる傾向が見られた
これはプロモータ自体の特性という可能性と実験操作のミスが主に考え得る
しかしながら、以前の大腸菌の生存曲線作成時、
作ってから日数のたった過酸化水素の各濃度ストックは揮発性により実験結果に影響が出たという事例がある
次回以降は、過酸化水素ストックの濃度、及び実験操作に留意し、実験を行う予定である

September 21

Time

9：00～

Member

古道、竹内、臼井、革島、中村、吉村
Furumichi,Takeuchi,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura

Purpose

  1. Measurement of absorbance of AcrAB and digestion by restriction enzymes.[Kawashima]
  2. Isolation of AcrAB、dps、pSB1C3、RFP and yaiA from agarose gel.[Kawashima]
  3. GFP fluorescent strength measurement of oxyR,ahpC and sufA.[Nakamura]
  4. DNA miniprep of promoterless CFP(E0420), promoterless YFP(E0430) and digestion by restriction enzymes.[Yoshimura]
  5. PCR of dps and digestion of dps by restriction enzymes.[Furumichi]
  6. Concentration of AcrAB、dps、RFP、yaiA.[Furumichi,Takeuchi]
(1)　PCR済AcrAB 1,2の吸光度測定→制限酵素処理　[革島]
(2)　AcrAB、dps、pSB1C3、RFP、yaiA 1,2のゲル抽　[革島]
(3)　ahpC、oxyR、sufAの蛍光強度測定　[中村]
(4)　promoterless CFP(E0420), promoterless YFP(E0430)のプラスミド抽出と制限酵素処理　[吉村]
(5)　dpsのPCRとPCR後の制限酵素処理　[古道]
(6)　DNA抽出後のAcrAB、dps、RFP、yaiA 1,2の濃縮　[古道、竹内]

Method

(1)　PCR済AcrAB 1,2の吸光度測定→制限酵素処理
　＊吸光度測定
　　　100倍希釈で測定した
　＊制限酵素処理
　　　AcrAB 1　　　50μLに対してEcoRⅠ1μL、speⅠ0.5μLでTotal100μLになるよう処理した
　　　AcrAB 2　　　110μLに対してEcoRⅠ1μL、pstⅠ1μLでTotal1500μLになるよう処理した
(2)　AcrAB、dps、pSB1C3、RFP、yaiA 1,2のゲル抽
　9月15日のカラム不使用と同様
(3)　ahpC、oxyR、sufAの蛍光強度測定
　ahpCに関しては、前日から振とう培養していたものと、今日21日に培養したものの2つを行った
　oxyR、sufAに関しては、今日培養したものを使って、実験を行った
　実験操作は20日参照
　　＊前回、H2O2のストックに問題があるのではとの考えが生じた為、H2O2の各濃度ストックから作製した
(4)　promoterless CFP(E0420), promoterless YFP(E0430)のプラスミド抽出と制限酵素処理
　各サンプルを培養した
　　　培養条件: 3時間, 3mlのLB(ampicilin 終濃度50ul/ml)
　↓Cfg.14,000 30sec　で遠心した
　↓Cfg.14,000rpm 30sec　で遠心したのち、100ulのsolⅠを加えた
　↓vortexにより懸濁したのちsolⅡを200ul加え、2分後にsolⅢを150ul加えた
　↓Cfg.14,000rpm 10min　で遠心したのち、上清を回収し、200ulのフェノール/CIAAを加えた
　↓vortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5min　で遠心した
　↓上清を回収し、さらにCIAAを200ul加えvortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5minで遠心した
　↓上清を回収し、500ulのイソプロパノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した
　↓上清を取り除き200ulの７０％エタノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した
　↓上清を取り除いた後、サンプルを乾燥させ（TOMY micro vac MV-100 30sec）30ulのTE-RNaseに溶解させた
　以上の操作において、solⅠ,solⅡ,solⅢは以下のものを用いた
　　　SolⅠ: 50mM グルコース, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA
　　　SolⅡ: 0.2N NaOH, 1%SDS
　　　SolⅢ: 5M CH3COOK,CH3COOH
　制限酵素処理を行うために吸光度を測定した
　吸光度より下表1の組成で制限酵素処理を行った
　ネガティブコントロール用に5μlだけDNAを残した
　これを37℃のインキュベーターに入れた(overnight)
表1: 制限酵素処理
DNA23.8μl
EcoRⅠ0.3μl
XbaⅠ0.3μl
M Buffer5μl
Milli Q20.6μl
Total50μl
(5)　dpsのPCRとPCR後の制限酵素処理
　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)をすでにMixしたプライマー(dps)を
　各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた
　↓それぞれのエッペンに下表2の組成で溶液を加えた
　↓下表3のプログラムでPCR反応を行った
　↓電気泳動にかけた
　↓吸光度測定した(100倍希釈)
　↓制限酵素処理を以下の条件で行った
　↓37℃、一晩、インキュベート
表2: PCR試薬組成
テンプレートDNA(DH5α)各 0.5μL
10xPCR Buffer for KOD-Plus-5μL
2mM d NTPs5μL
2mM MgSO44μL
MilliQ33μL
KOD-Plus-1μL
表3: dpsのPCR反応
熱変性熱変性アニーリング伸長反応伸長反応保存
94℃94℃60℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec30sec2min保持
35サイクル
表4: dps 1(284µg/ml)
DNA(dps)40μl
Buffer H5μl
H2O2.378μl
EcoRⅠ1.135µl
PstⅠ1.262µl
total50µl
表5: dps 2(319μg/ml)
DNA(dps)40μl
Buffer H5µl
H2O2.307μl
EcoRⅠ1.276μl
total50µl
(6)　DNA抽出後のAcrAB、dps、RFP、yaiA 1,2の濃縮
　DNA抽出後のAcrAB、dps、RFP、yaiA 1,2にDNAの5倍量の100％エタノールを加えた
　↓DNAの1/5倍量のCH3COONaを加えた
　↓4℃、14,000rpm、20min遠心
　↓上澄みを除き70％エタノールを200µl加えた
　↓4℃、14,000rpm、10min遠心
　↓上澄みを除き30µlのRNase入りのTEを加えた
　　(本来ならこの手順の前に乾燥が必要なのだがここでは行わなかった)
　↓吸光度測定をした


Results

(1)
表5: 吸光度測定
1/100AcrAB 1AcrAB 2
OD2600.1380.357
DNA濃度(ng/μL)6901875
全量(μL)40110
(2)　吸光度は誤差の範囲でしか得られなかったため、(6)で濃縮を行った
(3)
表6: ahpCの蛍光強度測定
1nM5nM10nM50nM100nM
ahpC 111.5711.5910.8210.185.896
ahpC 211.2511.6810.9411.368.862
表7　ahpC、oxyR、sufAの蛍光強度測定
1nM5nM10nM50nM100nM1μM
ahpC13.551.34413.7515.3415.2112.69
oxyR6.9406.1856.0446.5196.0465.571
sufA0.23070.22960.24550.25460.19850.2269
(4)
表8: 吸光度測定結果
1/500CFPYFP
1回目0.1480.174
2回目0.1470.174
3回目0.1430.164
4回目0.1470.166
5回目0.1430.163
平均0.14560.1682
DNA濃度3460ng/μl4205ng/μl
(5)　電気泳動の結果、綺麗にバンドが検出され十分なPCR処理が認められた
表9: 吸光度測定結果
1/100dps 1dps 2
1回目0.0590.069
2回目0.0580.067
3回目0.0570.065
4回目0.0580.059
5回目0.0520.059
平均005680.0638
DNA濃度284μg/ml319μg/ml
(6)
表10: 吸光度測定結果
AcrABdpsRFPyaiA 1yaiA 2
濃度37.6ng/μl14.4 ng/μl17.6ng/μl19.8ng/μl13.0ng/μl

Consideration

(2)　切り取ったバンドが太すぎたことが原因であったと考えられる
(3)　今回H2O2を新しく調整して実験を行ったが、前日同様 、濃度に比例した蛍光強度は得られなかった
しかし、これは1nM∼100nM付近での現象であり、
全体を通しての傾向ではないので、ペンの機能的には問題ないかと思われる
また、sufAの蛍光強度の結果に関しては、きわめて低い値が出てしまったのは、
おそらく実験操作中に何かしらの操作ミスが考えられる
(4)　DNA濃度が十分であることからプラスミド抽出に成功したと言える
(5)　制限酵素処理したPCR済dpsは次回以降にゲル抽出する
(6)　吸光度測定の結果より、十分な濃度のDNAが取れた

September 22

Time

9：00～

Member

福山、竹内、臼井、革島、中村、吉村
Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura

Purpose

  1. GFP fluorescent strength measurement of ahpC and sufA.[Nakamura]
  2. Isolation of ahpC、dps、CFP、YFP、pSB1C3 and RFP from agarose gel.[Kawashima,Yoshimura]
  3. PCR of ahpC and sufA.[Usui]
  4. DNA miniprep of pSB1C3.[Usui]
(1)　ahpC、sufAのGFP蛍光強度測定　[中村]
(2)　ahpC、dps、CFP、YFP、pSB1C3、RFP のゲル抽　[革島、吉村]
(3)　ahpC,sufAのPCR　[臼井]
(4)　pSB1C3のアルカリミニプレップ　[臼井]

Method

(1)　ahpC、sufAのGFP蛍光強度測定
22日朝から3h、37℃で振とう培養したものの内、各1本ずつを実験に用いた
また、今回は過酸化水素濃度を終濃度、
1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nMおよび過酸化水素を加えないH2O2lessの8種類で比較実験を行った
　＊実験操作は20日参照
(2)　ahpC、dps、CFP、YFP、pSB1C3、RFP のゲル抽
　下表1の組成でゲルにアプライした
　↓50Vで30分間電気泳動した
　↓UVを照射してゲルを切り出した
　↓切り出し後
　↓(井沢先生流)
　↓H2O　400μL
　↓65℃　40min
　↓ほとんど溶けなかったのでゲルを取り出し溶けた分でゲル抽を進めた
　↓Phe等量　voltex
　↓　cfg.　14,500rpm　5min　25℃
　↓上清を新チューブへ
　↓Phe/Chl等量　voltex　　
　↓　cfg. 14,500rpm　5min　25℃
　↓上清を新チューブへ
　↓3M CH3COONa　50μL、イソプロ　800μL　　　　
　↓　cfg.　14,500rpm　10min　4℃
　↓上清除き、70％EtOH 150μL
　↓　cfg.　14500rpm 5min 4℃
　↓ 乾燥機　5min
　↓MilliQ　10μL
表1: 試薬組成
ahpC、dps、pSB1C3、RFP
DNA50μl
Loading Buffer10μl
CFP、YFP
DNA45μl
Loading Buffer9μl
(3)　ahpC,sufAのPCR
　9月15日とまったく同じ試薬の組成、温度設定でsufA,ahpCについて各4本ずつPCRを行った
　　　→これらのうち二本は制限酵素処理(片方はE-Sで処理、もう片方はE-Pで処理)を行い、後の二本は保存した
表2: 試薬組成
DNA(sufA,ahpC)24μL
10xH-Buffer4μL
H2O10.5μL(10μL)
EcoRⅠ1μL
SpeⅠ(PstⅠ)0.5μL(1μL)
全量40μL
(4)　pSB1C3のアルカリミニプレップ
　菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した
　↓cfg.4℃ 6,000rpm 2min
　↓上清を捨て、SolutionⅠ 100μLを加えて、上下に反転させた
　↓常温で5min放置
　↓SolutionⅡ 200μLを加えて上下に反転
　↓on ice 5min
　↓SolutionⅢ 150μLを加えて、vortex
　↓on ice 5min
　↓cfg.4℃ 15,000rpm,5min
　↓上清を1.5mLエッペンにとり、ΦOH/CIAA 200μLを加えてvortex
　↓cfg.4℃ 1,5000rpm,5min
　↓上部の水層を1.5mLエッペンに移し、100%EtOH 1mLを加え、上下に反転した
　↓常温10min放置
　↓cfg.4℃ 15,000rpm,12min
　↓70%EtOH 500μL
　↓cfg.4℃,15000rpm,3min
　↓EtOHをアスピレーターで取り除き、2min遠心乾燥した
　↓TE30μLを加え溶解した
　↓吸光度を測定し、制限酵素処理を行った
表3: 制限酵素処理試薬組成
pSB1C3のDNA26μL
10xH-Buffer4μL
EcoRⅠ1μL
PstⅠ1μL
H2O9μL
全量40μL

Results

(1)　
表4: ahpC、sufAのGFP蛍光強度
H2O2less1nM10nM100nM1μM10μM100μM1mM
ahpC14.4914.3214.3414.2415.0119.2619.1922.92
sufA3.9723.7723.9133.8623.8833.8444.0974.711
　＊測定は3回行い、その平均を取った
　＊添付ファイルにグラフ添付
(2)　電気泳動の結果、全体的にバンドの判別が難しく、RFPとdpsは切り出せなかった
　また、マーカーが十分に展開されていなかった
表5: DNA濃度
CFPpSB1C3
OD2600.0160.012
DNA濃度6080
全量99
1%アガロースゲルは30MilliQには溶けなかったので溶出した分で井沢先生流ゲル抽出を行った
がしかし、やはりバンドの部分が溶けておらず結果は良くなかった
YFP、ahpCは吸光度マイナスが出たので破棄した
(3)　PCR産物の吸光度を測る時間がなかったので次の日に測定していると思います
(4)
表6: ミニプレ後の吸光度
pSB1C3: 100倍希釈
一回目0.581
二回目0.567
三回目0.559
四回目0.561
五回目0.559
Ave0.565
濃度2825ng/μL

Consideration

(1)　前回同様、低濃度域において、蛍光強度が過酸化水素濃度に比例しない値をとったが、
全体を通してはahpC、sufAともにおおよそ、濃度に比例する値が得られた
(2)　結果より、電気泳動の時間が短すぎたと思われる
井沢先生流でゲル抽を行う場合、MilliQに溶ける1％低融点ゲルを使用する必要がある
(4)　濃度がミニプレの割に低いのはおそらくミニプレ事態のミスではなく
pSB1C3の菌液事態が濃度が薄かったためだと考えられる

September 23

Time

9：00～

Member

竹内、臼井、革島、中村、吉村
Takeuchi,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura

Purpose

  1. Cultivate of sufA　pSB1C3.[Kawashima]
  2. Picking up single colony of ahpC　pSB1C3.[Kawashima]
  3. DNA miniprep of sufA(pSB1C3) and digestion by restriction enzymes.[Kawashima]
  4. DNA miniprep of RFP(promoterless) and digestion by restriction enzymes.[Nakamura]
  5. PCR of dps.[Nakamura]
  6. PCR of ahpC.[Usui]
  7. Measurement of absorbance of oxyR,SodA,sufA,yaiA,AcrAB and ahpC and digestion by restriction enzymes.[Usui]
(1)　sufA　pSB1C3の液体培養　[革島]
(2)　ahpC　pSB1C3のシングルコロニーピックアップ　[革島]
(3)　sufA(pSB1C3)のプラスミド抽出と制限酵素処理　[革島]
(4)　RFP(promoterless)のミニプレ→制限酵素処理　[中村]
(5)　dpsのPCR　[中村]
(6)　ahpCのPCR　[臼井]
(7)　oxyR,SodA,sufA,yaiA,AcrAB,ahpCの濃度測定と制限酵素処理　[臼井]

Method

(1)　sufA　pSB1C3の液体培養
　LB(amp-)4ml、クロラムフェニコール(50ng/μL)4μL加えた試験管4本に植菌
(2)　ahpC　pSB1C3のシングルコロニーピックアップ
　LBプレート(クロラムフェニコール＋)1枚(6分割)に植菌
(3)　sufA(pSB1C3)のプラスミド抽出と制限酵素処理
　平常通りプラスミド抽出を行った
　手順は９月２１日と同じ
　↓吸光度を測定し、下表1の組成で制限酵素処理を行った
　↓37℃のインキュベーターの中に入れた(overnight)
表1: 制限酵素処理1
DNA28.8μl
EcoRⅠ0.3μl
SpeⅠ0.16μl
H Buffer5μl
Milli Q15.74μl
Total50μl
(4)　RFP(promoterless)のミニプレ→制限酵素処理
　RFP(promoterless)をLB培地(l)3mLに2本分培養した
　↓これをアルカリミニプレップし、TE(RNase入)30μLに溶かした
　↓DNA濃度のより大きいほうをDNAsol 3μLでE-X制限酵素処理を行った(Overnight)
表2: 制限酵素処理2
DNAsol3μL
EcoRⅠ1μL
XbaⅠ1μL
10xM5μL
H2O40μL
Final50μLx4本
(5)　dpsのPCR
　下表3の試薬組成で、下表4のプログラムに従って行った
表3:試薬組成
dpsM0.75μL
Buffer2.5μL
dNTPs2.5μL
KOD-Plus1μL
H2O16.5μL
Final25μL
表4: PCRプログラム
熱変性熱変性アニーリング伸長反応伸長反応保存
94℃94℃60.2℃68℃68℃4℃
2min30sec30sec30sec2min保持
35サイクル
(6)　ahpCのPCR
　9月15日とまったく同じプログラム、試薬組成で4本ずつPCRを行った
(7)　oxyR,SodA,sufA,yaiA,AcrAB,ahpCの濃度測定と制限酵素処理
　oxyR,SodA,sufA,yaiA,AcrAB,ahpCの吸光度を測定し、E-SまたはE-Pで制限酵素処理を行った
　試薬組成は9月22日と同様

Results

(1)　生育した
(2)　翌日生えていた
(3)
表5: 吸光度測定結果
1/500
1回目0.498
2回目0.506
3回目0.512
4回目0.504
5回目0.503
平均0.5046
(4)
表6: DNA濃度
DNA濃度全量
RFP19,189ng/μL29μL
RFP212,060ng/μL17μL
(5)　明日、吸光度測定および制限酵素処理予定
(6)　→(7)で使用
(7)　それぞれ1はE-Sで制限酵素処理、2はE-Pで制限酵素処理するもの
yaiAはE-Pで処理、ahpCはE-Sで処理
表7: 濃度測定結果
oxyR 1oxyR 2SodA 1SodA 2sufA 1sufA 2yaiAAcrAB 1AcrAB 2ahpC
10.0720.0820.0590.0660.0660.0570.0780.0750.0670.071
20.0750.0840.0710.0600.0770.0560.0830.0960.0970.071
30.0760.0930.0680.0590.0710.0620.0810.0750.0710.066
40.0770.0950.0650.0600.0740.0610.0800.0900.0720.067
50.0730.0780.0650.0630.0700.0600.0790.0730.0700.067
Ave0.07460.08640.06560.06160.07160.05920.08020.08180.06940.0672
濃度ng/μL373432328308358292401409347336
※制限酵素処理に関して、
　SpeⅠが途中でなくなってしまい、AcrABを除くE-Sでの処理が行えなかった
　またこのときすでにEcoRⅠは加えてしまった後だったので、翌日(25日)にフェノクロ処理を行い、
　PCR産物をEcoRⅠだけで切れた状態にし、SpeⅠが届き次第制限酵素処理を行える状態にした

Consideration

(3)　吸光度測定結果より、DNA濃度が十分であることからプラスミド抽出に成功したといえる

September 24

Time

9：00～

Member

福山、竹内、臼井、中村、吉村
Fukuyama,Takeuchi,Usui,Nakamura,Yoshimura

Purpose

  1. Isolation ofpSB1C3(BBa_J04450) and pSB6A1(BBa_I13507) from agarose gel.[Fukuyama,Takeuchi]
  2. Cultivate of pSB6A1(SufA,GFP),pSB6A1(ahpc,GFP).[Fukuyama]
  3. Renewing of master plates.[Fukuyama]
  4. Measurement of absorbance of dps.[Fukuyama]
  5. Agarose gel electrophoresis of dps.[Fukuyama]
  6. Isolation of acrAB、oxyR、sodA、sufA、yaiA and pSB1C3 from agarose gel.[Nakamura]
  7. Concentration ahpC,oxyR,SodA and sufA by phenol/chloroform.[Usui]
(1)　pSB1C3(BBa_J04450),pSB6A1(BBa_I13507)のゲル抽出　[福山、竹内]
(2)　pSB6A1(SufA,GFP),pSB6A1(ahpc,GFP)の液体培地での培養　[福山]
(3)　Amp入りのプレート培地にはえている
DH5α 　pSB6A1(promoter less,YFP)
　　　　pSB6A1(promoter less,CFP)
　　　　pSB6A1(SodA,GFP)
　　　　pSB6A1(SufA,GFP)
　　　　pSB6A1(dps,GFP)
　　　　pSB6A1(OxyR,GFP)
　　　　pSB6A1(AcrAB,GFP)
　　　　pSB6A1(ahpc,GFP)　　　　の、新しいAmp入りプレート培地へのうえつぎ　[福山]
(4)　前日にPCRしたdpsの吸光度測定　[福山]
(5)　制限酵素処理を終えたpSB1C3(SufA)のカットチェック　[福山]
(6)　acrAB、oxyR、sodA、sufA、yaiA、pSB1C3のゲル抽出　[中村]
(7)　前日にEcoRⅠでしか切ることのできなかったahpC,oxyR,SodA,sufAのフェノクロ処理　[臼井]

Method

(1)　pSB1C3(BBa_J04450),pSB6A1(BBa_I13507)のゲル抽出
　制限酵素処理を終えたpSB1C3(BBa_J04450)とpSB6A1(BBa_I13507)を
　50μlにつき3μlずつCIAPを加えて37℃でインキュベート
　↓低融点ゲルを用いたゲル抽出を行った
(2)　DH5α pSB6A1(SufA,GFP),pSB6A1(ahpc,GFP)の液体培地での培養
　Amp入りのLBプレート培地にはえているDH5α(pSB6A1(SufA,GFP)とpSB6A1(ahpc,GFP))を
　Amp入りLB液体培地で、37℃で6時間ほど振とう培養した
　↓冷蔵庫に保管した
(3)　Amp入りのプレート培地にはえているDH5αのうえつぎ
　　　pSB6A1(promoter less,YFP)
　　　pSB6A1(promoter less,CFP)
　　　pSB6A1(SodA,GFP)
　　　pSB6A1(SufA,GFP)
　　　pSB6A1(dps,GFP)
　　　pSB6A1(OxyR,GFP)
　　　pSB6A1(AcrAB,GFP)
　　　pSB6A1(ahpc,GFP)
　を、新しいAmp入りプレート培地へそれぞれストリークし、37℃でインキュベートした
(4)　前日にPCRしたdpsの吸光度測定
　前日にPCRしたdpsの吸光度測定を100倍希釈したDNA溶液を用いて行った
(5)　制限酵素処理を終えたpSB1C3(SufA)のカットチェック
　１kbp DNA ladder,制限酵素処理を終えたpSB1C3(SufA),アルカリミニプレップを終えたpSB1C3(SufA),PCR後のSufAを
　2％アガロースゲルで135V15分間電気動した
　↓EtBr入り染色液で15分間染色した
　↓UVをあてて写真撮影し、バンドの大きさと数を確認した
(6)　acrAB、oxyR、sodA、sufA、yaiA、pSB1C3のゲル抽出
　E-Pカットで制限酵素処理した各プロモーターとベクター(pSB1C3)を青ゲルを用いて抽出した

　

　プロモーター溶液(24μL)に対し5μL、ベクター溶液(49μL)に対し9μLのOrange Bufferを加えた
　↓1％低融点アガロースの青ゲルで、100V、25min電気泳動した
　↓各バンドを切り出した
　↓水400μLを加え、60℃のヒートブロックで溶解させた(vortex)
　↓等量のフェノールを加えた
　↓　cfg.　25℃　13,000rpm　5min
　↓新しいエッペンに上清を回収した
　↓ΦOH/CIAAをエッペンの8割程度(約800μL)まで加え、vortexにより混合した
　↓　cfg.　25℃　13,000rpm　5min
　↓新しいエッペンに上清を回収した
　↓CH3COONa50μL、イソプロパノール800μLをそれぞれ加えた
　↓　cfg.　4℃　14,500rpm　10min
　↓上清を捨てた
　↓70％EtOH500μLを加えた
　↓　cfg.　4℃　14,50rpm　5min
　↓EtOHを捨てた
　↓2min　遠心乾燥し、1xTE(RNase入)30μLに溶解した
　↓冷蔵保存
(7)　前日にEcoRⅠでしか切ることのできなかったahpC,oxyR,SodA,sufAのフェノクロ処理
　前日にSpeⅠのストックがなくEcoRⅠだけで切った状態のahpC,oxyR,SodA,sufAの4種類のプロモーターに関して、
　フェノクロ処理を行い、制限酵素およびその試薬を取り除いた
　ΦOH/CIAA 200μLを加えた
　↓cfg.4℃ 15,000rpm,5min
　↓上部の水層を回収し、100%EtOH 1mLを加えた
　↓室温　10min
　↓cfg.4℃ 15,000rpm,12min
　↓上清を捨て、70%EtOH 500μLを加えた
　↓cfg.4℃ 15,000rpm,3min
　↓EtOHを取り除き、遠心乾燥2min
　↓H2O 30μLに溶解

Results

(1)　十分なバンドを確認することができなかったため、DNAを得ることができなかった
(2)　培養できていた。これは予備で培養したものなので以後使わない可能性もある
(3)　培養できていたのかどうかはまだ今日は確認できていない。明日の朝すぐに確認できると思われる
(4)　測定結果を下表1に示した
表1: 吸光度測定結果
1/100dps 1dps　2
1回目0.060.085
2回目0.0540.084
3回目0.0510.091
4回目0.0510.086
5回目<?TD>0.050.086
平均0.05320.0864
表から求めたdps 1の濃度：266ng/μl
表から求めたdps 2の濃度：432ng/μl
(5)　制限酵素処理後→1kb と2kbのバンドが一本ずつ確認できた
制限酵素処理前→3kbのバンドが確認できた
SufAのみ→1kbのバンドが見られた
以上の結果より、制限酵素処理は成功していると考えた。→明日以降にゲル抽出
また、制限酵素処理前のアルカリミニプレップを終えた試料では、
DH5αのゲノムDNAのバンドがpSB1C3(SufA)のバンドと同じくらいはっきり出ていた
(6)　各プロモーターに関しては、バンドが確認できた(oxyRなど薄いバンドもあった)
しかし、pSB1C3に関しては、バンドが見えず、切り出しができなかった
今回得られた、各プロモーターDNAについては、後日ライゲーション予定
(7)
表2: 吸光度(1/100)
sufASodAahpCoxyR
10.0400.0410.0280.018
20.0390.0230.0330.025
30.0350.0270.0270.020
4-0.043--
5-0.031--
Ave0.0380.0330.02930.021
濃度ng/μL190165147105

Consideration

(1)　泳動時間が十分でなかったことが主な原因であると考えられる
次回からはこまめにバンドの移動を確認して泳動時間を調節するべきである
(5)　アルカリミニプレップの操作の過程で、大腸菌のゲノムDNAは除かれると期待していたが
電気泳動の結果からいって、ゲノムDNAは十分に除去されているとはいえない
これでは、吸光度の値から求めるプラスミドの濃度は正確にでていない可能性がある
(6)　今後は、青ゲルでバンドが見えない場合は、念のためUV下で確認すること
(7)　フェノクロ処理後の濃度はPCR後の濃度よりも下がってしまう

September 25

Time

9：00～

Member

福山、臼井、中村、吉村
Fukuyama,Ysui,Nakamura,Yoshimura

Purpose

  1. DNA miniprep of pSB1C3.[Yoshimura]
  2. Cultivate of pSB1C3(J04450).[Fukuyama]
  3. Cultivate of pSB6A1(I13507).[Fukuyama]
  4. Isolation of pSB6A1(ahpc,GFP) and pSB6A1(SufA,GFP) from agarose gel.[Fukuyama]
  5. GFP fluorescent strength measurement of TetR,K121013,ahpC and sufA.[Usui,Nakamura]
(1)　提出用pSB1C3のプラスミド抽出　[吉村]
(2)　pSB1C3(J04450)の培養　[福山]
(3)　pSB6A1(I13507)のAmp入りLB液体培地での培養　[福山]
(4)　pSB6A1(ahpc,GFP),pSB6A1(SufA,GFP)のゲル抽出　[福山]
(5)　ahpC,sufA,TetR,K121013の蛍光強度測定　[臼井、中村]

Method

(1)　提出用pSB1C3のプラスミド抽出
　各サンプルを培養した
　培養条件: 3時間, 3mlのLB(ampicilin 終濃度50ul/ml)
　↓Cfg.14,000 30sec　で遠心した
　↓Cfg.14,000rpm 30sec　で遠心したのち、100ulのsolⅠを加えた
　↓vortexにより懸濁したのちsolⅡを200ul加え、2分後にsolⅢを150ul加えた
　↓Cfg.14,000rpm 10min　で遠心したのち、上清を回収し、200ulのフェノール/CIAAを加えた
　↓vortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5min　で遠心した
　↓上清を回収し、さらにCIAAを200ul加えvortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5minで遠心した
　↓上清を回収し、500ulのイソプロパノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した
　↓上清を取り除き200ulの70％エタノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した
　↓上清を取り除いた後、サンプルを乾燥させ(TOMY micro vac MV-100 30sec)30ulのTE-RNaseに溶解させた
　以上の操作において、solⅠ,solⅡ,solⅢは以下のものを用いた
　SolⅠ: 50mM グルコース, 25mM Tris-HCl,, 10mM EDTA
　SolⅡ: 0.2N NaOH, 1%SDS
　SolⅢ: 5M CH3COOK,CH3COOH
(2)　DH5α(pSB1C3(BBa_J04450))の培養
　9月16日からLB寒天培地に培養して保管していたDH5α(pSB1C3(BBa_J04450))を
　白金耳でつついて、その先を3 mlのLB液体培地につけてゆらした
　↓同じ操作を8回繰り返して8試料つくった
　↓また、100mlのLB液体培地にも同様の操作をおこなった
　↓37℃、overnightで振とう培養した　　
(3)　DH5α(pSB6A1:promoter less,RFP)のAmp入りLB液体培地での培養
　LB寒天培地に培養して保管していたDH5α(pSB6A1:promoter less,RFP)を
　白金じでつついて、その先を3 mlのLB液体培地につけてゆらした
　↓同じ操作を10回繰り返して10試料つくった
　↓37℃、overnightで振とう培養した　　
(4)　pSB6A1(ahpc,GFP),pSB6A1(SufA,GFP)のゲル抽出
　1%アガロースゲルを用いて、EcoRⅠとSpeⅠで切断されたpSB6A1(ahpc,GFP)、pSB6A1(SufA,GFP)を100Vで25分間電気泳動した
　確認のため、同時に各試料2～3 μlずつとって1％アガロースゲルを使って135Vで15分間電気泳動した
　↓確認のための電気泳動でバンドを確認
　↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した
　↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた
　↓フェノールを430 μlほど加えた
　↓遠心（13000 rpm、5分間、25℃）
　↓上清を回収
　↓フェノールクロロフォルムを加えるはずが、間違えてイソプロパノールを加えてしまった


(5)　ahpC,sufA,TetR,K121013の蛍光強度測定
　菌液濁度(O.D.600)を0.4~0.6に調整した
　↓終濃度がlessおよび1nM～1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した
　↓37℃でインキュベートし、10分ごとに菌液500μLずつ回収した
　↓cfg.4℃,14000rpm,1min
　↓上清を除いた
　↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した
　↓全量を蛍光強度測定に用いた
　※この操作を80分まで行った

Results

(1)　電気泳動の結果、インサート＋ベクターの長さが3141bpなのに、2100bpのところにバンドが出ていた
吸光度を測定し、DNA濃度を測定したところ、4825ng/μl(全量150μl)だった
(2)　今日の時点ではまだ培養できているのかわからない
(3)　今日の時点ではまだ培養できているのかわからない
(4)　イソプロパノールを加えた時点で、どうすればいいのかわからず、結局どちらの試料とも廃棄した
(5)　結果は29日の実験ノートにExcelファイルで添付

Consideration

(1)　プラスミドを環状のままにして電気泳動してしまったため、予想された場所にバンドがでなかったと思われる
(5)　菌液の量が少なかったため、80分しか測定ができなかったので以後の実験では菌液量を増やし改善


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