Team:KIT-Kyoto/Notebook-week5

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	Sun	Mon	Tue	Wed	Thu	Fri	Sat
Week1	-	-	-	08-11-2010	08-12-2010	08-13-2010	08-14-2010
Week2	08-15-2010	08-16-2010	08-17-2010	08-18-2010	08-19-2010	08-20-2010	08-21-2010
Week3	08-22-2010	08-23-2010	08-24-2010	08-25-2010	08-26-2010	08-27-2010	08-28-2010
Week4	08-29-2010	08-30-2010	08-31-2010	09-01-2010	09-02-2010	09-03-2010	09-04-2010
Week5	09-05-2010	09-06-2010	09-07-2010	09-08-2010	09-09-2010	09-10-2010	09-11-2010
Week6	09-12-2010	09-13-2010	09-14-2010	09-15-2010	09-16-2010	09-17-2010	09-18-2010
Week7	09-19-2010	09-20-2010	09-21-2010	09-22-2010	09-23-2010	09-24-2010	09-25-2010
Week8	09-26-2010	09-27-2010	09-28-2010	09-29-2010	09-30-2010	10-01-2010	10-02-2010
Week9	10-03-2010	10-04-2010	10-05-2010	10-06-2010	10-07-2010	10-08-2010	10-09-2010
Week10	10-10-2010	10-11-2010	10-12-2010	10-13-2010	-	-	-

September 5

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Time

9：30～

Member

岩城、竹内、吉村

Iwaki,Takeuchi,Yoshimura

Purpose

The insertion of a target plasmid is confirmed by pSB1C3(J04450) digestion by restriction enzymes.[Iwaki]
Isolation of pSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507) and pSB6A1(K121013) fragments from agarose gel.[Yoshimura,Takeuchi]
DNA ligation and Transformation.[Iwaki,Takeuchi]

(1)　前日にシングルコロニーピックアップをしたpSB1C3(J04450)を

制限酵素処理を行うことにより、目的プラスミドの挿入を確認した

(2)　プロモーター挿入用のpSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507)

インサートを切り出してI13507の挿入用のpSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出

(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

Method

(1)　pSB1C3のプラスミド抽出と制限酵素処理による確認

　前日に2つのシングルコロニーをピックアップし2 mlのLB培地(+Cam)で37℃で一晩培養した

　↓1.5 mlをチューブに採った

　↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓カラムを新しいチューブに乗せ換えた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　それぞれ10 µlを別のチューブに採った

　↓H bufferを5 µl加えた

　↓蒸留水を34 µl加えた

　↓EcoRⅠとPstⅠを0.5 µlずつ加えた

　↓37℃で1.5時間インキュベートした

　↓1 %ゲルを用いて、100 Vで25分間電気泳動した

　↓20分間EtBrで染色した

　↓紫外線を照射し写真を撮影した

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出

　PCR用のpSB6A1,RFP,pSB6A1を右表1,2の組成で平常通り制限酵素処理した

　↓右表3,4の組成でゲルにアプライした

　↓50Vで30分間電気泳動した

　↓UVを照射してゲルを切り出した

　↓H2O　400μLを加えた

　↓65℃　40minでヒートブロック

　↓Phe等量加えて　vortex

　↓cfg.　14500rpm　5min　25℃

　↓上清を新チューブへ

　↓Phe/Chl等量　voltex　　

　↓cfg. 14500rpm　5min　25℃

　↓上清を新チューブへ

　↓3M CH₃COONa　50μLを加えた

　↓イソプロ　800μLを加えた

　↓cfg.　14500rpm　10min　4℃

　↓上清除き、70％EtOH 150μL

　↓cfg.　14500rpm 5min 4℃

　↓遠心乾燥機　5min

　↓MilliQ　10μLを加えた

表1: PCR用pSB6A1
DNAsol	262μL
EcoRⅠ	4μL
XbaⅠ	4μL
Buffer M	30μL
total	300μL

表2: RFP,pSB6A1
DNAsol	85μL
EcoRⅠ	2.5μL
PstⅠ	2.5μL
Buffer H	10μL
total	100μL

表3: PCR用のpSB6A1
DNA	300μl
Orange Loading Dye	50μl

表4: RFP,pSB6A1
DNA	100μl
Orange Loading Dye	20μl

(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

　コンピテントセルにDNAを入れた

　↓20分間氷冷した

　↓43℃のウォーターバスに45秒間いれた

　↓5分間氷冷した

　↓SOC培地を900μl加えた

　↓20分間,37℃のインキュベーターに入れた

　↓13000rpm,4℃,1分間遠心した

　↓培養液を少し捨て量を減らし、ピペッティングした

　LBプレートにまき、37℃のインキュベーターに入れてovernight

Results

(1)　以下のようにサンプルを泳動した

レーン1	1Kb Maker
レーン2	コロニー1から抽出したプラスミド
レーン3	コロニー1から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの
レーン4	コロニー2から抽出したプラスミド
レーン5	コロニー2から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの

レーン2と4で同じ長さのバンドが確認できた

またレーン3と5では2本のバンドが確認でき、3と5で長さに違いはなかった

(2)　RFPのバンドが見られなかった

(3)　全てのプレートでコロニーの生育が見られた

Consideration

(1)　pSB1C3はベクター2072bp・インサート1069bpであり、

インサート部分の両端に今回使用した制限酵素で切断できる部位をもつので

電気泳動の結果と照らし合わせるとどちらのコロニーも目的プラスミドの挿入がなされていると考えられる

これを用いてマスタープレート・グリセロールストックの作成をする

(2)　制限酵素処理に失敗したと思われる

September 6

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Time

8:30～20:30

Member

岩城

Iwaki

Purpose

DNA miniprep of pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430) and pSB6A1(K121013).[Iwaki]
pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013) digestion by restriction enzymes.[Iwaki]
Isolation of pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430) and pSB6A1(K121013) fragments from agarose gel.[Iwaki]
Ligation of RFP-pSB6A1(K121013),CFP-pSB6A1(K121013) and YFP-pSB6A1(K121013).[Iwaki]

(1)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する

(2)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する

(3)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出

(4)　RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える

AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する

Method

(1)　プラスミド抽出

　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の

　4種のプラスミドの抽出をした(カラムを使用したミニプレップ)

(2)　制限酵素処理

　(1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した

　(1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした

　RFP,CFP.YFP用をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した

　promoter用をEcoRⅠとXbaⅠの2種の制限酵素で切断した

(3)　ゲル抽出

　(2)で制限酵素処理したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の

　インサートと pSB6A1(K121013)のベクターのゲル抽出を行った(青ゲル)

(4)　LigationとTrans formation

　(3)でゲル抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の

　インサートと pSB6A1(K121013)(RFP,CFP,YFP用)のLigationを行った

　前日にゲル抽出済みの AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターと

　(3)でゲル抽出したpSB6A1(K121013)(promoter用)のLigationを行った　

　LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした

Results

ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった

それ以外に関してはTFまで完了した

以下の計5種

　　pSB6A1(E0430)

　　pSB6A1(E0420)

　　pSB6A1(K362007)

　　pSB6A1(K362011)

　　pSB6A1(K362013)

Consideration

試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い

確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる

September 7

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Time

9：00～

Member

岩城、福山、竹内、中村

Iwaki,fukuyama,Takeuchi,Nakamura

Purpose

Picking up single colony of pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507),pSB6A1(E0430),pSB6A1(K362011) and pSB6A1(K362039).[Fukuyama]
Concentrate AcrAB by Phenol/chloroform and digestion by restriction enzymes.[Fukuyama]
DNA miniprep of pSB1A2(I13507).[Fukuyama]
PCR of AcrAB.[Nakamura]
DNA miniprep of pSB1A2(I13507).[Iwaki,Takeuchi]
DNA miniprep of lacZ.[Takeuchi]

(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507),

pSB6A1(E0430),pSB6A1(K362011),

pSB6A1(K362039)のコロニーをピックアップ [福山]

(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理　[福山]

(3)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップと濃縮　[福山]

(4)　AcrABのPCR　[中村]

(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ

(6)　lacZのアルカリミニプレップ

Method

(1)　コロニーをピックアップ

　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507),

pSB6A1(E0430),pSB6A1(K362011),

pSB6A1(K362039)

　それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした

　↓37℃でインキュベートした

(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理

　PCR処理済みのAcrAB溶液400μlにMilliQ200μl加えた

　↓フェノールクロロホルム溶液を1.2mlほど加えてピペッティングし、vortexした

　↓室温、14,500rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し、これに2-プロパノールを1.2mlほど加えた

　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを1.2mlほど加えた

　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した

　↓上清を捨てた

　↓遠心乾燥機で乾燥した

　↓MilliQを30μl加えた

　↓5μlとって2％アガロースゲル電気泳動で確認した(300bpあたりにバンドが見えた)

　↓100倍希釈で吸光度を計測した

　↓濃縮したプラスミド溶液24μlに下表2に従い各試薬を加えた

　↓調整した試料を37℃で一晩インキュベートした

表1: 吸光度計測結果
AD₂₆₀	0.071
	0.069
	0.069
	0.07
	0.071
平均	0.07

表2: 試薬組成
AcrAB	24μl
EcoRⅠ	0.84μl
PstⅠ	0.933μl
H Buffer	2.6μl
MilliQ	21.6μl
全量	約50μl

(3)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップと濃縮

　pSB6A1(I13507)を1.5mlエッペンチューブにうつした

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を回収した

　↓溶出液量に対して酢酸ナトリウムを1/10倍、イソプロパノールを等量加えて混ぜた

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を捨て、遠心乾燥機で乾燥した

　↓MilliQを30μl加えた

(4)　AcrABのPCR

　下表1,2に示した試薬組成、設定に従ってPCRを行った

組成
AcrABM	1.5μL
Buffer	5μL
dNTPs	5μL
KOD-Plus	1μL
MgSO₄	4μL
鋳型DNA	0.5μL
H₂O	33μL
Total	50μL

PCR設定
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	60.2℃	68℃	68℃	4℃
5min	15sec	30sec	20sec	2min	∞
	30サイクル

(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ

　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ

　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓電気泳動した

(6)　lacZのアルカリミニプレップ

　集菌後、水分を十分に取り除き、SolutionⅠ250μLを加えた

　↓vortexにより混合した後、SolutionⅡ250μLを加え、上下に2，3度転倒させて混ぜた

　↓SolutionⅢ350μLを加え、よく混合した

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min

　↓上清をカラムに移した

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　30sec　カラム下部の液を捨てた

　↓SolutionⅣ500μLを加えた

　↓cfg.　20℃　13,000rpm　1min　カラム下部の液を捨てた

　↓SolutionⅤ700μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　1min×２

　↓酢酸ナトリウム50μL、イソプロパノール800μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　10min

　↓上清を除いた

　↓70%EtOHをエッペンの8分目まで加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min

　↓遠心乾燥　2min

　↓滅菌水100μLに溶かした

Results

(1)　翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した

(2)　制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない

翌日以降、電気泳動によって確認し、問題がなければゲル抽出する

(3)　どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である

翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う

(4)　ゲル抽出をするのに十分な濃度の試料を得ることができた。

(5)　バンドは検出できなかった、iGEMの製作した試薬には問題ありと考えられる

(6)　lacZの吸光度は0,1468（×1/100）でDNA濃度は734g/μLであった

　　　→冷蔵保存

September 8

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Time

9：00～

Member

岩城、福山、古道、竹内、中村

Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

DNA miniprep of pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420) and pSB1A2(E0430).And concentration of those.[Fukuyama]
Cultivate pSB6A1（E0420).[Fukuyama]
PCR of SodA,OxyR and yaiA.[Furumichi]
SodA,OxyR and yaiA concentrate by phenol/chloroform.[Furumichi]
2-propanol precipitation of pSB1C3.[Nakamura]

(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮

(2)　pSB6A1（E0420）の培養

(3)　SodA,OxyR,yaiAのPCR

(4)　PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理

(5)　pSB1C3のイソプロ沈

Method

(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮

　4時間ほどLB液体培地で培養した各E.Coliをそれぞれ1.5mlエッペンに8割ほど移した

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して

　　それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。

　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓MilliQを各種プラスミドにつき30μlずつ加えた

(2)　pSB6A1（E0420）の培養

　前日にAmp入りLB寒天培地にストリークしたpSB6A1(E0420)を

　2mlのLB液体培地が入った試験管6本に一部うつして　　　　　

　振とう培養した

(3)　SodA,OxyR,yaiAのPCR

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を

　すでにMixしたプライマー(SodA, OxyR,yaiA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下表1の組成で溶液を加えた

　↓下表2,3のプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR産物を電気泳動にかけた

表1: 試薬組成
テンプレートDNA(DH5α)	各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO₄	4μL
MilliQ	33μL
KOD-Plus-	1μL
total	50μL

表2: SodA,OxyRのPCR反応
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	62.7℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	保持
	30サイクル

表3: yaiAのPCR反応
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	60.4℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	38sec	2min	保持
	30サイクル

(4)　PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理

　PCR済のSodA, OxyR,yaiAにそれぞれ200µlずつ滅菌水を加えた

　↓フェノールクロロホルム(φ OH/CIAA)200µl加えた

　↓4℃、14,000rpmで10min遠心した

　↓上清を回収しそれにクロロホルムイソアミルアルコール(CIAA)を200µl加えボルテックスした

　↓4℃、14,000rpmで10min遠心した

　↓上清を回収しそれに3M CH₃COONaを50µl加え混ぜた

　↓イソプロパノール0.5ml加えて混ぜ4℃、14,000rpmで20min遠心した

　↓上澄みを捨て70％エタノール200µl加え4℃、14,000rpmで10min遠心した

　↓上澄みを捨てて乾燥させた

　↓滅菌水を30µl加えた

　↓冷蔵保存した

(5)　pSB1C3のイソプロ沈

　TEに溶かした状態のpSB1C3ベクター50μLに、CH₃COONa50μL、イソプロパノール800μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　15min

　↓上清を捨てた

　↓70%EtOH800μLを加えた

　↓cfg.　25℃　14,500rpm　5min

　↓EtOHを除いた

　↓遠心乾燥　2min

　↓滅菌水30μLに溶かした

Results

(1)　まだどれほどの量でプラスミドが回収できたのかは分からない

(2) 培養に成功していれば明日にもアルカリミニプレップを行う予定

(3)　PCR産物を電気泳動にかけた結果、すべて、バンドが検出されたので、今後使用するものとする

(4)　実験(3)で得られたPCR産物のクロロホルム処理を行い冷蔵保存した

これを次回の実験に用いる(制限酵素処理など)

(5)冷蔵保存

September 9

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Time

9：00～

Member

竹内、中村、吉村

Takeuchi,nakamura,Yoshimura

Purpose

DNA miniprep of pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507).[Yoshimura]
Isolation of pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430) and pSB1A2(R0040) fragments from agarose gel.[Yoshimura]
Absorbance determination of oxyR, sodA, and yaiA.[Nakamura]

(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出　[吉村]

(2)　(1)と前日(9/8)にプラスミド抽出した

pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出　[吉村]

(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定　[中村]

Method

(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出

　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)を1.5mlエッペンチューブにうつした

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓CH₃COONaとイソプロパノールを

　　溶出液量に対してそれぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓MilliQを30μl加えた

(2)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出

　今回は青ゲルを使わずにUV照射でバンドの位置を確認してゲル抽出を行う方法をとった

　DNAを下表1,2,3のように制限酵素処理した

　↓3時間,37℃でインキュベート

　↓アガロースゲルに下表4の全量をapplyした

　↓50V,50minで電気泳動した。

　↓20min EtBrに浸した

　↓暗室でUVをゲルに照射し、バンドの位置を確認してゲルを切り出した

表1: CFP
DNA	40μl
EcoRⅠ	1.5μl
XbaⅠ	1.5μl
M Buffer	5μl
milliQ	2μl
total	50μl

表2: RFP,YFP
DNA	30μl
EcoRⅠ	1.5μl
XbaⅠ	1.5μl
M Buffer	5μl
milliQ	12μl
total	50μl

表3: TetR
DNA	30μl
EcoRⅠ	1.5μl
PstⅠ	1.5μl
H Buffer	5μl
milliQ	12μl
total	50μl

表4: 試薬組成
Marker(1kb)	3μl
Loadiing Buffer	10μl
DNA	全量

(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定

冷蔵保存されていたoxyR、sodA、yaiA on pSB6A1をそれぞれ、100倍希釈で吸光度測定した

Results

(2,3)　CFP,YFP,TetRはバンドが見え、切り出しに成功した

　⇒冷蔵庫に保存、翌日のLigationに使用する

　RFPはバンドが見えなかった

　⇒ミニプレの必要あり

(4)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定結果(100倍希釈)

	吸光度	DNA濃度
oxyR	0.018(5回平均)	90ng/μL
sodA	0.058(5回平均)	290ng/μL
yaiA	0.029(5回平均)	145ng/μL

September 10

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Time

9：00～

Member

福山、竹内、臼井、吉村

Fukuyama,Takeuchi,Usui,Yoshimura

Purpose

Cultivate of pSB1A2(I13522) and pSB1A2(J04450).[Usui]
Ligation of pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430) and pSB1A2(R0040).[Yoshimura]
Activity of ahpC and sufA is examined.[Usui]
All promoter digestion by restriction enzymes.[Usui]
DNA miniprep of pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450) and pSB1A2(I13522).And concentration of those.[Fukuyama]
To examine the promoter activity in the opposite direction of OxyR, Inverted LacZ is made by PCR. [Yoshimura]

(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(J04450)の培養　[臼井]

(2)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430)とpSB1A2(R0040)のライゲーション　[吉村]

(3)　ahpC,sufAの活性確認　[臼井]

(4)　全プロモーター(予備は除く)の制限酵素処理　[臼井]

(5)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ、濃縮　[福山]

(6)　OxyRの逆向きのプロモーター活性を調べるためにInverted LacZをPCRにより作成する　[吉村]

Method

(1)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450)の培養

　pSB1A2(I13522),pSB1A2(J04450)をマスタープレートより白金耳でひっかき、

　LB(+amp)の培地3mLで各3本ずつ37℃で培養した

(2)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430)とpSB1A2(R0040)のライゲーション

[1] CFP,RFP,YFP,TetR-GFPのDNAのゲルからの抽出

　切りだしたゲルを入れたエッペンに400μlのmilliQを入れた

　↓65℃でゲルを溶かした

　↓フェノールをエッペンの8割くらいまでいれて、vortexした

　↓14,500rpm,5min,4℃で遠心した

　↓上清を回収し、フェノールクロロホルムをエッペンの8割くらいまで加えた

　↓14,500rpm,5min,4℃で遠心した

　↓上清を回収し、イソプロパノール 800μl,CH₃COONa 50μlを加えた

　↓14,500rpm,10min,4℃で遠心した

　↓70％EtOH 200μlを加えた

　↓14,500rpm,3min,4℃で遠心した

　↓遠心乾燥器にかけた

　↓30μlのmilliQに溶かした後吸光度を測定しDNA濃度を調べた

[2] pSB6A2(k121013)とpSB1A2(I13522)のligation

　ligationはT-4ligaseを用いて以下の条件で行った

A(insert:vector=1:2)
Insert(TetR-GFP)	1μl
Vevtor(pSB6)	7.8μl
Buffer	1μl
T-4ligase	1μl
MilliQ	0μl
Total	10.8μl

B(insert:vector=1:10)
Insert(TetR-GFP)	1μl
Vevtor(pSB6)	4.2μl
Buffer	1μl
T-4ligase	1μl
MilliQ	3μl
Total	10μl

　A、B両サンプルをそれぞれ16℃で1時間インキュベートした

　以上の2サンプルについては以下の条件でトランスフォーメーションを行った

　　DH5α50μlに以上の2サンプル全量を加え混ぜた後、30分間氷上で静置した

　　↓43℃で40秒インキュベートした後、10分間氷上で静置した

　　↓この各サンプルをLBプレート(+amp　終濃度50μg/ml)にまき37℃でインキュベートした(overnight)

(3)　ahpC,sufAの活性確認

　ahpC,sufAに関して100倍希釈の吸光度5回測定し、平均値より各濃度を算出した

ahpC
1回目	0.211
2回目	0.210
3回目	0.204
4回目	0.200
5回目	0.198
Ave	0.2046
濃度1023ng/μL

sufA
1回目	0.161
2回目	0.164
3回目	0.165
4回目	0.160
5回目	0.159
Ave	0.1618
濃度809ng/μL

(4)　全プロモーター(予備は除く)の制限酵素処理

　ahpC(全量240μL),AcrAB(全量45μL),dps(全量195μL),SodA(全量135μL),

　sufA(全量240μL),oxyR(全量45μL),yaiA(全量135μL)の七種類のプロモーターに関して、

　濃縮を以下の手順で行い、制限酵素処理を行った

[濃縮]

　DNA溶液の全量をxμLとして、DNA溶液に1/10x μL　3M CH₃COONa,x μL　isopropanolを加えた

　↓cfg.14000rpm,20min,4℃

　↓上清を捨て、70%EtOHを加えた

　↓cfg.14000rpm,10min,4℃

　↓上清を捨て遠心乾燥 30sec.

　↓それぞれのDNAにH₂O 30μLを加えた

[制限酵素処理]

＜組成＞
DNAサンプル	30μL
10×H-Buffer	4μL(1×として使用)
EcoRⅠ	0.4μL
SpeⅠ	0.2μL
H₂O	5.4μL
Total	40μL

　これを37℃,overnightで培養した

(5)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ、濃縮

pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)を

それぞれ別々に1.5mlエッペンチューブにうつした

　↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓CH₃COONaとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓TE(10μlTris-HCl pH8.0/1mM EDTA)をそれぞれ30μlずつ加え、冷蔵庫で保管した

(6)　OxyRの逆向きのプロモーター活性を調べるためにInverted LacZをPCRにより作成する

[1]Inverted LacZ 作成のためのPCR

　鋳型DNAとしてiGEMで登録されているpSB1A2(I732019)を用いた

　PCRの条件は以下の条件で行った

Sample A
鋳型DNA(810ng/ul)	0.5ul
MgSO₄	1ul
dNTP	2ul
KODplus	0.5ul
Primer(forward)	0.5ul
Primer(Reverse)	0.5ul
Buffer	2ul
MilliQ	13ul
Total	20ul

Sample B
鋳型DNA(810ng/ul)	0.5ul
MgSO₄	2ul
dNTP	2ul
KODplus	0.5ul
Primer(forward)	0.5ul
Primer(Reverse)	0.5ul
Buffer	2ul
MilliQ	12ul
Total	20ul

PCR反応
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	63℃	75℃	75/TD>	4℃
2min	30sec	30sec	30sec	10min	保持
	35サイクル

　合成したプライマーを以下に示した

Primer(forward)	5’-CAGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGTATAAACGCAGAAAGGCCCA
Primer(Reverse)	5’-ACGTACTAGTAGCGGCCGCTGCAGAAAGAGGAGAAATACTAGAT

　以上の条件によりPCRで増幅させたサンプルを電気泳動し、増幅の確認を行った

Results

(1)　翌日、培養の成功を確認した

(2) それぞれのDNA濃度を以下にまとめた

　　　CFP 280ng/μl

　　　YFP 450ng/μl

　　　TetR－GFP 400ng/μl

翌日コロニーができていた

(3) 濃度の測定で十分量と判断し、以後の実験に使用した

(4) 翌日11日に結果記載

(5) どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である

明日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う

(6) Ⅰのサンプルではバンドがみられなかったが、Ⅱのサンプルではバンドが見えた

　　　⇒Ⅱのサンプルでバンドが見られたことから、次回からPCRするにはⅡの条件で行うのがよい

TetR-GFPのインサートが937bpなので、今回得られたバンドは少しそれより長いものと考えられる

急ぎなのでこのまま使用するが、本来ならカットチェックを行う必要がある

September 11

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9：00～

Member

福山、古道、竹内、臼井、革島、中村

Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Kawashima,Nakamura

Purpose

Picking up single colony of pSB6A1(I13522) and DNA miniprep of pSB6A1(I13522).[Takeuchi]
Streaking of pSB6A1(I13522).[Furumichi]
Cultivate of pSB6A1(K362036) and miniprep of this and digestion by restriction enzymes.[Usui]
PCR of lacZ and digestion by restriction enzymes .[Takeuchi]
Isolation of promoter fragments from agarose gel.[Furumichi]
DNA miniprep of lacZ and digestion by restriction enzymes.[Takeuchi]
Pre-culture of pSB1A2(I13522),pSB6A1(K121013),pSB6A1(I13522).[Kawashima]
Measurement of absorbance of pSB6A1(J04450),pSB6A1(I13507) and pSB1A2(I13522) and digestion by restriction enzymes.[Kawashima]
DNA miniprep of pSB6A1(K362036).[Fukuyama]
Isolation of SodA,sufA,ahpC,oxyR and dps fragments from agarose gel.[Usui]
Ligation of SodA,sufA,ahpC,oxyR and dps.[Usui]

(1)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のピックアップ、ミニプレップ　[竹内]

(2)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のストリーク　[古道]

(3)　pSB6A1(K362036)の培養6本→アルカリミニプレップ→制限酵素処理(over night)　[臼井]

(4)　LacZ(inverted)のPCR2本、35サイクル→制限酵素処理(over night)　[竹内]

(5)　Promoterのゲル抽出(全種類)　[古道]

(6)　プロモーターレスLacZのミニプレ→制限酵素処理　[竹内]

(7)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(K121013),pSB6A1(I13522)のプレカルチャー　[革島]

(8)　前日にアルカリミニプレップした

pSB6A1(J04450),pSB6A1(I13507),pSB1A2(I13522)

の吸光度の測定と制限酵素処理　[革島]

(9) pSB6A1(K362036)のアルカリミニプレップ　[福山]

(10)　AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの電気泳動　[福山]

(11)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのゲル抽出　[臼井]

(12)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのライゲーション　[臼井]

Method

(1)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のピックアップ、ミニプレップ

　ライゲーション済pSB6A1(I13522)をピックアップした

　↓4時間程37℃振とう培養した

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

(2)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のストリーク

　amp入りLBプレートにライゲーション済pSB6A1(I13522)をストリークした

(3)　pSB6A1(K362036)の培養6本→アルカリミニプレップ→制限酵素処理(over night)

　試験管で培養した試料をカラムなしのミニプレ処理を行いDNAを抽出した

　そして、抽出後の試料にEcoRⅠ,PstⅠでの制限酵素処理を行った

　組成を下表1に示した

表1: 制限酵素処理組成
DNAsol	3μL
EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL
10×H	5μL
H₂O	40μL
Total	50μL

(4)　LacZ(inverted)のPCR2本、35サイクル→制限酵素処理(over night)

　Inverted lacZのPrimer(forward)1.5μl、Primer(Revese)1.5μlを500μlエッペンに分注した

　↓それぞれのエッペンに下表2の組成で溶液を加えた

　↓下表3に示したプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR済のInverted lacZの吸光度測定し、DNA濃度を算出した

　↓下表4の組成でエッペンに分注し、制限酵素処理を行った

　↓これを37℃でインキュベートした(overnihgt)

表2: 試薬組成
pSB1A2(BBa-I732019)	各 1μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO₄	4μL
MilliQ	31μL
KOD-Plus-	1μL

表3: PCR反応
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	63℃	75℃	75℃	4℃
2min	30sec	30sec	30sec	10min	保持
	35サイクル

表4: 制限酵素処理
PCR済Inverted lacZ	A	B
DNA	40μl	40μl
EcoRⅠ	1.796μl	0.94μl
SpeⅠ	0.997μl	0.522μl
Buffer H	5μl	5μl
Milli Q	2.207μl	3.538μl
total	50μl	50μl

(5)　Promoterのゲル抽出(全種類)

AcrAB,ahpC,dps,oxyR,,SodA,sufA,yaiA過酸化水素応答性プロモーター7種類に対してカラムを使わないゲル抽出を行った

(6)　プロモーターレスLacZのミニプレ→制限酵素処理

　遠心1分(20℃、14,000rpm)して集菌(菌液を使いきるまで)

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、よくボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,000rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,000rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　プロモーターレスLacZの制限酵素処理

　EcoRⅠ、pstⅠでカット。Total50μL

(7)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(K121013),pSB6A1(I13522)のプレカルチャー

　プレートを4分割してそれぞれをストリーク、1つはNothingとした

　↓37℃でインキュベートした(over night)

(8)　pSB6A1(J04450),pSB6A1(I13507),pSB1A2(I13522)

の吸光度の測定と制限酵素処理

　前日にアルカリモニプレップと濃縮を終えていた3試料を100倍希釈して吸光度(260nm)を測定した

試料A	pSB6A1(BBa_J04450,RFP)
試料B	pSB6A1(BBa_I13507,RFP,promoter less)
試料C	pSB1A2(BBa_I13522,TetR)

　↓下表5に従い試料を調整した

　↓37℃でインキュベート

表5: 試薬組成
	試料B(μl)	試料C(μl)
DNA溶液	29	29
EcoRⅠ	0.15	0.8
SpeⅠ	0.085
XbaⅠ		0.89
Buffer H	5	5
Milli Q	15.8	14.31
合計	約50	約50

(9) pSB6A1(K362036)のアルカリミニプレップ

　遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水100μlをカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収した

(10)　AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの電気泳動

　前日(10日)にEcoRⅠ-SpeⅠでカットしておいた

　AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの七種類のプロモーターに関して

　1%アガロースゲル(ゲル抽出用)で50V-45minの条件で電気泳動を行った

(11)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのゲル抽出

＜方法＞

　抽出(QIAGENのQIAquick®Gel Extraction kit(250)を使用)

　切りだしたゲルの重さを事前に量った

　↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート

　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた。

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた。

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた。

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓内5μLを濃度測定に使用した(H2Oを95μL加え20倍希釈とした)

(12)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのライゲーション

　CFP-On pSB6(ローコピーベクター)、各種プロモーターおよび、

　YFP-On pSB6(ローコピーベクター)、各種プロモーターのligation

　ligationはT-4lagaseを用いligation条件を以下の条件で行った

CFP-on pSB6,各種プロモーターのligation

[Ⅰ] insert:vector=1:2

Insert(sufA)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	2.4μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	0.2μl
Total	10μl

Insert(sodA)	6μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	1.3μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	0.9μl
Total	10μl

Insert(ahpC)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	2.5μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	0.7μl
Total	10μl

Insert(oxyR)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	3.4μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	0μl
Total	10μl

Insent(dps)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	3.6μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	0.2μl
Total	10μl

YFP on pSB6,各種プロモーターのligation

[Ⅰ] insert:vector=1:2

Insert(sufA)	6μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	1.8μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	0.4μl
Total	10μl

Insert(sodA)	6μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	0.8μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	1.4μl
Total	10μl

Insert(ahpC)	6μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	1.9μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	0.3μl
Total	10μl

Insert(oxyR)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	2.5μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	0.7μl
Total	10μl

Insent(dps)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	2.7μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	0.5μl
Total	10μl

CFP-on pSB6,各種プロモーターのligation

[Ⅱ] insert:vector=1:5

Insert(sufA)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	1μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	2.2μl
Total	10μl

Insert(sodA)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	0.4μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	2.8μl
Total	10μl

Insert(ahpC)	6μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	1μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	1.2μl
Total	10μl

Insert(oxyR)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	1.4μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	2.8μl
Total	10μl

Insent(dps)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	1.5μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	2.7μl
Total	10μl

YFP-on pSB6,各種プロモーターのligation

[Ⅱ] insert:vector=1:5

Insert(sufA)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	0.6μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	2.6μl
Total	10μl

Insert(sodA)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	0.3μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	2.9μl
Total	10μl

Insert(ahpC)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	0.6μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	2.6μl
Total	10μl

Insert(oxyR)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	0.85μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	2.35μl
Total	10μl

Insent(dps)	5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)	0.9μl
Buffer	1μl
T-4ligase	0.8μl
Milli Q	2.3μl
Total	10μl

以上の条件で作成したすべてのサンプルについてトランスフォーメーションを行い大腸菌に形質転換させた

　DH5α50μlに以上のサンプル全量をそれぞれ加え混ぜた後、3min氷上で静置した

　↓43℃で30秒インキュベートした後、10分間氷上で静置した

　↓この各サンプルをLBプレート(+amp 終濃度50μg/ml)にまき37℃でインキュベートした(overnight)

Results

(1)　ライゲーション済TetR・GFPのミニプレップ処理後は保存し、次回吸光度測定をした

(2)　翌日生えていた

(3)　十分な量のDNAを抽出できたので予定通り、制限酵素処理を行った。

(4)

PCR済Inverted lacZ①吸光度(100倍希釈)
	0.094
	0.090
	0.089
	0.091
	0.085
平均	0.0898
DNA濃度	4.49×10²(µl/ml)

PCR済Inverted lacZ①吸光度(100倍希釈)
	0.050
	0.046
	0.048
	0.050
	0.041
平均	0.0470
DNA濃度	2.35×10²(µl/ml)

制限酵素処理後はDNA抽出を行う

(5)　AcrAB,ahpC,dps,oxyR,,SodA,sufA,yaiAのうちAcrAB,ahpC,sufAがゲル抽出に成功した

ゲル抽出に成功した試料の濃度は以下の通り

	AcrAB	ahpC	sufA
濃度	28 ng/μL	1238 ng/μL	640 ng/μL

(6)　プロモーターレスLacZのミニプレ

	Sample1(1/20)	Sample2(1/20)	Sample3(1/200)
OD₂₆₀	0.546	0.210	0.072
DNA量	546ng/μL	210ng/μL	720ng/μL
全量	90μL	95μL	50μL

(7)　翌日生えていた

(8)　吸光度(260nm)の測定結果を示す

	試料A	試料B	試料C
	0.004	0.01	0.057
	0.002	0.01	0.05
	0.007	0.01	0.053
	0.01	0.011	0.054
	0.004	0.011	0.062
平均	0.0054	0.0104	0.0552

試料A; pSB1A2(BBa_I13522,TetR) → 非常に薄くて使えないことが分かったので破棄

試料B; ｐSB6A1(BBa_J04450,RFP) → 薄かったけれどとりあえず制限酵素処理をした

試料C; pSB6A1(BBa_I13507,RFP,promoter less) → 薄かったけれどとりあえず制限酵素処理をした

(9)　まだ濃度が分からない状態。あす以降に吸光度を測定する

(10)　AcrABはゲル抽出が可能な量を得られなかった

これはPCRがうまくいっていなかったと考えられる

また、yaiAはアガロースゲルのコームが貫通していたため溶液が流れ出てしまい、ゲル抽出が不可能だった

残りの五つに関しては十分量得られたのでゲル抽出に移った

(11)各DNA濃度を以下に示した

SodA
1	0.021
2	0.021
3	0.022
4	0.030
5	0.022
Ave	0.0232

sufA
1	0.052
2	0.060
3	0.053
4	0.052
5	0.052
Ave	0.0538

ahpC
1	0.055
2	0.053
3	0.055
4	0.055
5	0.056
Ave	0.0548

oxyR
1	0.077
2	0.078
3	0.078
4	0.071
5	0.077
Ave	0.0762

dps
1	0.072
2	0.093
3	0.091
4	0.080
5	0.074
Ave	0.082

(12)　次の日(12日)にコロニーがはえていた

コロニー数は非常に少ない。これは時間の関係上回復培養を行っていなったためでると考えられる

Consideration

(5)　4つの試料のゲル抽出が成功しなかったのはミニプレ後の試料のDNA濃度が不十分であったためであると考えられる