Team:KIT-Kyoto/Notebook-week2

August 15

Time

9:00～18:00

Member

坂田(15:00∼),臼井,革島,中村,吉村

Sakata,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura

Purpose

1. Miniprep pSB3K3(J04450)

2. Digested these and Ran on a Gel

・pSB1A2(J44000)

・pSB3K3(J04450)

(1)　pSB3K3(J04450)のアルカリミニプレップ

(2)　pSB1A2(J44000)及びpSB3K3(J04450)が大腸菌に挿入されているかどうか制限酵素処理によって確認する

Method

(1)　pSB3K3(J04450)のアルカリミニプレップ

　培養後のpSB3K3(J04450)を1.5mLエッペンチューブに取った

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した

　↓5min on ice

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、15,000rpm、20min遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを捨てた

　↓30sec　遠心乾燥した

　↓RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした

(2)pSB1A2(J44000)及びpSB3K3(J04450)のカットチェック

＜組成＞ pSB1A2 5μL pSB3K3 5μL EcoRⅠ 1μL EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL PstⅠ 1μL Buffer(H) 1μL Buffer(H) 1μL H2O 11μL H2O 11μL 計 20μL 計 20μL

これを1h,37℃でインキュベートした 　↓Loading Buffer　1μLを加えたものと、 　　マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gelのコームに流し込んだ 　↓100V,30min泳動した 　↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した 　↓泳動結果を写真で撮影した

Results

(1)　抽出したプラスミドを冷蔵保存した

(2)　pSB1A2

　→4つ中2番にバンドが確認された。

　　　2番（プレカルチャーしておいたもの）にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した

(3)　pSB3K3

　→4つ中1，2番の2本にバンドが確認された

　　　LB培地（kan+）2mLを加え、振とう培養した

Consideration

(1)　翌日、制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する

(2)　翌日以降、培養を続けプラスミドを大量に回収する

August 16

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Time

9:00～17:00

Member

岩城,福山,竹内,臼井,足立,中村,革島

Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Adachi,Nakamura,Kawashima

Purpose

1. Cuitivate pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450) for recovery of plasmids.[Usui,Nakamura,Adachi]
2. Transform pSB1A2(E0240) into the competent cells(DH5 Alpha).[Usui,Nakamura]
3. Design primers for using PCR.[Iwaki,Takeuchi]

(1)　プラスミドを大量に回収するためにpSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を培養する　[臼井、中村、足立]

(2)　目的のインサートを持たないpSB1A2(J44000)を増やしていたため、

pSB1A2(E0240)をトランスフォーメーションしなおす

また、パーツ登録時に必要なpSB1C3(J04450)のトランスフォーメーションをする　[臼井、中村]

(3)過酸化水素応答プロモーターをPCR処理によって得るためのプライマーを設計する　[岩城、竹内]

Method

(1)　pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)の培養

　プレート培地上のコロニーからpSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)をピックアップし、

　各2本ずつ、それぞれYT培地30ml(+kan)・YT培地30ml(+amp)を使用し、37℃,overnightで振とう培養した

(2)　pSB1A2(E0240)及びpSB1C3(J04450)のトランスフォーメーション

　DH5αを on ice 10分

　↓pSB1A2(12-M)及びpSB1C3(3-A)をそれぞれ1μLずつ加え、on ice 30min.

　↓42℃で45秒間ヒートショックを行った

　↓on ice 2min.

　↓37℃に温めたSOC培地0.9mLを加え、37℃シェーカーで1時間振とう培養を行った

　↓培養した菌液全量をプレートにまいた

　↓37℃でインキュベートした(Overnight)

(3)　プライマーの設計

過酸化水素応答プロモーター配列をiGEM推奨のサイトGinkgo Bioworksを用いて編集し、プライマーを設計した

Results

(1)　プラスミドを抽出するのに十分な増殖が肉眼で確認できた

(2)　コロニーが生育した

(3)　後日、AcrABはPCR処理で上手く得ることができたが、

SodA,ProxyRに関してはPCR処理でうまく得ることができなかった

Consideration

(1)　翌日、プラスミド抽出を行う

(2)　翌日、シングルコロニーピックアップを行う

(3)　プライマー設計時に何かしらの間違いがあったものと考えられるが詳細はいまだ不明

August 17

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Time

9:00～17:00

Member

岩城,福山,古道,革島,吉村

Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Kawashima,Yoshimura

Purpose

1. The insertion of a target plasmid is confirmed by digestion by restriction enzyme of pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450). [Kawashima]
2. DNA miniprep of pSB3K3(J04450) and pSB6A(J04450).[Kawashima]
3. Preparing chemically competent cells.[Furumuchi・Yoshimura]
4. Pick up a single colony of pSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450) from plate.[Fukuyama]
5. Pre-culture of pSB3K3(J04450) and pSB6A2(J04450).[Kawashima]

(1)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する　[革島]

(2)　pSB3K3(J04450),pSB6A(J04450)のプラスミド抽出　[革島]

(3)　コンピテントセル(DH5α)の調整　[古道、吉村]

(4)　pSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のシングルコロニーのピックアップ　[福山]

(5)　pSB3K3(J04450),pSB6A2(J04450)のプレカルチャー　[革島]

Method

(1)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)のシングルコロニーと制限酵素処理、電気泳動

　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)のシングルコロニーをピックアップし、

　それぞれ以下の条件で6時間ほど振とう培養を行った

　　　pSB1A2(E0240)→LB(+amp)(2ml)

　　　pSB1C3(J04450)→LB(+cam)(2ml)

　↓それぞれにアルカリミニプレップを行った

　↓次の条件で制限酵素処理を行った

　　　ミリQ　11μl

　　　Hバッファー　2μl

　　　DNA(pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450))　5μl

　　　制限酵素(EcoRⅠ,PstⅠ)　各1μl

　↓37℃で1時間インキュベートを行った

　↓電気泳動を行った

(2)　pSB3K3(J04450),pSB6A(J04450)のミディプレップ

　大量培養しておいたpSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した

　↓比重計で、それぞれ等量を量った

　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した

　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした

　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した

　↓N3 4mLを加えた

　↓室温、12,000rpmで10分間遠心した

　↓上清を保存し、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた

　↓カラムの上にW8を10mL加え、洗浄した(×2)

　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4を5mL加え、DNAを洗浄した

　↓E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanolを3.5mL加えた

　↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓70% ethanolを3mL加えた

　↓15,000rpm、4℃で5分間遠心した　

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥させた

　↓TEを50μL加え、溶け切るまで冷蔵した

　↓この吸光度を計測した

(3)　コンピテントセルの調整

　DH5αをLBプレート(抗生物質の入ってない)に播いた

　↓37℃で一晩インキュベートした

(4)　pSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のシングルコロニーのピックアップ

　プレートにはえたpSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のコロニーを、

　それぞれ3つずつピックアップしてLB(+amp)液体培地3mlで6時間程度振とう培養した

(5)　pSB3K3,pSB6A2のプレカルチャー

　　pSB3K3(J04450)→LB(+kan)(2ml)

　　pSB6A2(J04450)→LB(+amp)(2ml)

　に入れ、6時間ほど振とう培養した

Result

(1)　バンドが検出できた

(2)　吸光度の結果

pSB6A1 pSB3K3 1回目 1.132 0.155 2回目 0.994 0.138 3回目 0.984 0.126 4回目 0.990 0.122 5回目 0.975 0.125 平均 1.015 0.1332

これよりpsB6A1のプラスミドの濃度は5075ng/μLであった この結果より、十分な量のプラスミド抽出ができたと確認できた これよりpSB3K3　のプラスミドの濃度は666 ng/μLである この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

(3)　後日、十分な数のコロニーを確認した

(4)　培養できていた

(5)　6時間後生えていた

Consideration

(1)　翌日以降、プラスミド回収のための培養を行う

(2)　抽出したプラスミドは冷蔵保存しておいてライゲーションに使用する

(3)　コンピテントセルの調整に引き続き使用する

(4)　翌日、プラスミド抽出をして制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する

(5)　次の培養のための種培養にする

August 18

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Time

9:00～

Member

岩城、古道、竹内、中村

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

1. Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
2. Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
3. Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
4. Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
5. Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
6. Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
7. DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]

(1)　pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る　[中村]

(2)　pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る　[中村,革島]

(3)　作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認　[古道]

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]

(5)　19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する　[岩城]

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養　[革島]

(7)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ　[竹内]

Method

(1)　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク

　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート（+amp）にストリーク

　↓37℃でインキュベート（Overnight）

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク

　pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート（+amp）にストリーク

　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)

(3)コンピタントセルの調整（17日の続き）

　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした

　↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した

　↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した

　↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた

　↓O.D＝0.4～0.8になるように調節した

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション

　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした

　↓37℃でインキュベート(Overnight)

(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー

　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした

　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養

　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋Cam）に大量培養

(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミディプレ

　大量培養させておいたpSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した

　↓比重計で、それぞれ等量を量った

　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した

　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした

　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した

　↓N3 4mLを加えた

　↓室温、12,000rpmで10min遠心した

　↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた

　↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×２)

　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した

＊以降の操作は翌日に繰り越した

Result

19日に確認を行った結果を以下に示す

(1)　psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった

(3)　次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、

前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた

(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了

(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミニプレ

　　→吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。

Consideration

(1)　pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。

これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる

(3)翌日、吸光度を測定する

(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。

pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。

Augsut 19

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Time

9:00～

Member

岩城、古道、竹内、中村

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Title

(1)　pSB1A2(I13522）とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク　[中村]

(3)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0420）のミディプレ(18日の続き)　[中村]

(4)　プロモーター（PoxyR、acrAB）のPCRと電気泳動　[竹内]

(5)　コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)　[古道]

Purpose

1. Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells.[Nakamura]
2. Picking up single colony of pSB1A2(I732019,I732950) and pSB4A5(K193602).[Nakamura]
3. DNA midiprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0420).[Nakamura]
4. Increasing promoter by PCR and checking by agarose gel electrophoresis.[Takeuchi]
5. Preparing chemically competent cells.[Furumichi]

(1)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のシングルコロニーを得る

(3)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ

(4)　プロモーター(PoxyR、acrAB)を増やし、それを確認する

(5)　18日の続きのコンピタントセル(DH5α)の調整を行う

Method

(1)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション

　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解

　↓DH5α100μLに対し、l13522[2-(8A)]及び、R0040(1-6I)各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合

　↓on　ice　30min

　↓45℃で45sec、ヒートショック

　↓on　ice　2min

　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた

　↓37℃で1h、振とう培養

　↓培養後、全量をLBプレート(+amp)に撒き、37℃でOvernight

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク

　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)をそれぞれ、LBプレート(+amp)に白金耳を用いて、ストリークした

↓37℃でインキュベート　

(3)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ

　E4が15mLチューブに出切りDNAが完全に溶出し終わってからisopropanol 3.5mLを加えた

　↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥した

　↓TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵した

　↓この吸光度を計測した

(4)　PoxyR、acrABのPCRと電気泳動

　PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った

＜組成＞ PrimerF 各1.5μL PrimerR 各1.5μL テンプレートDNA (DH5α、JM109) 1μL Buffer for KOD-Plus 5μL 2mM dNTPs 5μL 2mM MgSO4 2μL KOD-Plus(1U/μL) 1μL MilliQ 33μL

＜設定＞ Pre　Denature 94℃ 2min Denature 94℃ 15sec Annealing 62.8℃ 30sec Extension 68℃ 20sec 4℃ ∞

　PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした

　　　　DNA量　5μL

　　　　Loading Buffer　1μL

　の割合で、1%アガロースゲルを用いて100Vで15分間泳動した

(5)　コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)

　前日から振とう培養させておいたDH5αの濁度を測定すると、

　0.9と理想の数値O.D＝0.4～0.8からはずれていたので、

　全量250mlのうち125mlを残してそれにSOB培地125ml加えて更に2時間振とう培養した

　↓濁度を測定すると、0.92とまた増えすぎていたので、

　　全量250mlのうち125ml残してそれにSOB培地125ml加えて薄めた

　↓濁度を測定すると0.576で理想値に近づいたのでこのまま実験を行った

　↓遠心管に移して氷上10分間放置した

　↓4℃、4500rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨てて沈殿に84mlの氷令したTBに懸濁した

　↓4℃、4500rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨てて沈殿を20mlの氷令したTB(Transformation Buffer)に懸濁した

　↓1.5mlのDMSO(7％)を加え氷上で10分間放置した

　↓1.5mlエッペンチューブに300µlずつ分注し液体窒素の中に放り込んだ

　↓完成したコンピタントセルDH5αの形質転換効率を計るためにpUC19のベクターを用いて形質転換を行った

　↓各濃度のpUC19(0.005(ng/µl))、pUC19(0.05(ng/µl))、pUC19(0.5(ng/µl))を1µlと、

　　作成したコンピタントセルDH5α 100µlを混ぜた

　↓15分間氷上に放置した

　↓42℃で40秒間熱ショックを与えた

　↓10分間氷上に放置した

　↓4℃で保存した

　↓アンピシリン入りのLB(+amp)プレートに全量播いた

　↓37℃で一晩インキュベートした

Result

(1)　十分な数のコロニーを確認できた

(2)　シングルコロニーを得るのに十分な発育が確認できた

(3)　濁度を測定した結果を以下の表にまとめた

pSB1A2 pSB1C3 1回目 0.104 0.051 2回目 0.103 0.033 3回目 0.120 0.046 4回目 0.115 0.052 5回目 0.122 0.030 平均 0.113 0.0424

これよりpsB1A2のプラスミドの濃度は565ng/μLである この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した これよりpSB1C3のプラスミドの濃度は212 ng/μLである この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

(4)　PoxyRとAcrABの十分なバンドを確認することはできなかった

これはAnnealingの温度、もしくはマグネシウムの量が不十分であった可能性が考えられる

後日、Extensionが不十分であったことも判明した

(5)　形質転換効率はまだ導き出されてないコンピタントセルDH5αが完成した

20日にコロニー数を数えて形質転換効率を計測する

August 20

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Time

9:00～

Member

福山、古道、竹内、革島

Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Kawashima

Title

(1)　8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測　[古道]

(2)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)を翌日以降培養するための種培養　[革島]

(3)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ　[福山]

(4)　pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出　[福山、竹内]

Purpose

1. Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
2. Pre-culture pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040).[Kawashima]
3. DNA miniprep of pSB6A1(K121013) and pSB6A1(J04450).[Fukuyama]
4. Isolation of pSB6A1(J04450) and pSB3K3(J04450) from agarose gel.[Fukuyama,Takeuchi]

(1)　作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測

(2)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)を翌日以降培養するための種培養

(3)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のプラスミドDNAの抽出

(4)　pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

Method

(1)　コンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測

　8/19(木)に以下の条件で形質転換を行い、

　コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した

　　　pUC19・・・・・0.005ng/μL

　　　pUC19・・・・・0.05ng/μL

　　　pUC19・・・・・0.5ng/μL

　↓これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した

(2)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のプレカルチャー

　pSB1A2(I13522)を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)

　pSB1A2(R0040) を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)

(3)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ

　培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mLとった

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)

　↓5min on ice

　↓4℃、15,000rpmで10分間遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、15,000rpmで10分間遠心した

　↓上澄みを捨てた

　↓30秒間遠心乾燥を行った

　↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした

(4)　pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

　＜材料＞

　　　プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)

　　　1％アガロースゲル　Seakem GTG Agarose 2枚

　　　TAE Buffer

　　　Buffer QG

　　　Isopropanol

　50Vで60分間電気泳動を行った

　↓1％アガロースゲルにEtBrを添加し20分間染色した

　↓EtBrを取り除いた

　↓暗室、UV照射下でゲルのベクター部分を切り出した

　↓切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った

　　　　pSB6A1(J04450)・・・・・0.1923g

　　　　pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g

　↓ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた

　　　　pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL

　　　　pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL

　↓50℃のwater bathで10分間incubateした(4分毎にvoltex)

　↓溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた

　↓カラムに移し替え、10,000rpmで1分間遠心した

　↓抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた

　↓10,000rpmで1分間遠心した

　↓Buffer PE 0.75ｍLを加えた

　↓10,000rpmで1分間遠心した

　↓エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた

　↓1,000rpmで1分間遠心した

　↓別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた

　　(このエッペンの蓋は切っていない。)

　↓10,000rpmで1分間遠心した

　↓別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈した

Result

(1)　測定したコロニー数

pUC19	0.005ng/μL	0個
pUC19	0.05ng/μL	97個	→1μLあたりのコロニー数は1940×103個/μg
pUC19	0.5ng/μL	1464個	→1μLあたりのコロニー数は2928×103個/μg
			平均値：2.4×106CFU/μg(DH5αのコンピテンシー)

(2)　十分な増殖が確認できた

(3)　後日の電気泳動写真から十分な量のプラスミド抽出できたことが確認できた

(4) 十分な濃度の抽出を行うことができなかった

Consideration

(4)　濃縮作業がうまくいかなかったことが主要原因の一つであると考えられる

具体的には遠心時間が１０分では足りないと考えられる

あるいは培養した大腸菌がすでにプラスミドを失って可能性がある

これより、遠心時間は１０分より長くし、培養した試料を遅くとも翌日までには使うべきであると考えられる

August 21

>>top

Time

9:00～

Member

竹内、革島、足立、吉村

Takeuchi,Kawashima,Adachi,Yoshimura

Title

(1)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動　[革島 ]

(2)　pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ　[足立,吉村]

(3)　AcrAB,PoxyのPCR　[竹内]

Purpose

1. The insertion of pSB6A1(K121013) and pSB6A1(J04450) is confirmed.[Kawashima]
2. DNA miniprep of pSB1A2(R0040) and pSB1A2(I13522).[Adachi,Yoshimura]
3. PCR of AcrAB and OxyR.[Takeuchi]

(1)　DH５αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック

(2)　pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のプラスミド抽出

(3)　AcrAB,PoxyのPCR

Method

(1)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動

　8月20日(金)にアルカリミニプレップによって取り出したプラスミド、

　DNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))の確認を電気泳動によって行った

　pSB6A1(K121013)(左から2~5番目のコーム),

　pSB6A1(J04450)(左から6~8番目のコーム)を5μLずつ、

　それぞれLoading Buffer 1μLを加え6倍希釈にしコームに流した

　↓1kbp radder(1番左のコーム)をマーカーとして使用し、100vで25分間電気泳動を行った

　↓EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min

　↓泳動結果を写真撮影した

(2)　pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ

　8月20日(金)に培養したpSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)

　↓5分間、氷上で放置した

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)

　↓5分間、氷上で放置した

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)のイソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心

　↓30秒間、遠心乾燥を行った

　↓RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAとした

　制限酵素処理と電気泳動

右の表に従い試薬を調整し、これを37℃で1時間インキュベートした ↓Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した 　(マーカーは1kbp radderを使用した) ↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した ↓泳動結果を写真で撮影した

＜試薬組成＞ EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL プラスミドDNA (DH５α(R0040),DH５α(I13522)) 5μL H2O 11μL H Buffer 2μL 計 20μL

(3)　AcrAB,PoxyのPCR

　以下の試薬組成、プログラムに従ってPCRを行った

試薬組成 (1) (2) (3) テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL 2μL MgSO4 2μL 4μL 3μL primer F 1.5μL 1.5μL 1.5μL primer R 1.5μL 1.5μL 1.5μL KOD-Plusｰ 1μL 1μL 1μL H2O 33μL 31μL 32μL dNTPs 5μL 5μL 5μL total 50μL 50μL 50μL

Pre Denature Denature Annealing Extention 94℃ 94℃ 62.8℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 20sec 保持 35サイクル

　結果は写真参照

Results

(1)　写真の結果

pSB6A1(K121013)のバンドは4つとも見えなかった

　　　→アルカリミニプレップのやり直し

pSB6A1(J04450)の3つのバンドは、3つともバンドが見えた(ただし一番左のみ少し)

pSB6A1(J04450)に関しては十分量DH5αにベクターが組み込まれたとみなし実験でこれを使用した

(2)　DH５α(R0040),DH５α(I13522)それぞれ3種類ずつアプライしたのだが、

全てバンドがはっきりと見えたため、プラスミド挿入が成功していることが確認された

(3) 十分なバンドを確認することができなかった。

Consideration

(1)　pSB6A1(K121013)　→　アルカリミニプレップのやり直し

(3)　テンプレートDNAはもっと少なくするべき

　MgSO4は4 μlでやるべき

　プライマーが間違っている可能性もあり