Team:KIT-Kyoto/Notebook-week3

August 22

Time

9:00～

Member

古道、臼井、中村、足立

Furumichi,Usui,Nakamura,Adachi

Title

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動　[足立、臼井]

(2)　pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のプレカルチャー　[臼井]

(3)　AcrAB,oxyRのPCR　[臼井]

Purpose

1. Agarose gel electrophoresis of AcrAB and OxyR.[Adachi,Usui]
2. Pre-culture of pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950).[Usui]
3. PCR of AcrAB and OxyR.[Usui]

(1)　PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック

(2)　pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)の培養

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

Method

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動

　8月21日(土)にPCRで複製したAcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を

　各4本ずつ計12本電気泳動を行うことによりPCR産物の複製の程度を調べた

　AcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を

　各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した

　↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った

　↓EtBr(10mg/ml)で20分間染色した

　↓泳動結果を写真撮影した

※結果は写真参照

(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー

　プレート培地上からpSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のシングルコロニーをピックアップした

　↓各2本ずつ、3mLの液体LB培地(+amp)を使用し、37℃で振とう培養した(overnight)

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

　AcrAB,oxyRに関して8月21日の実験結果より

　以下のようにMg4μL、テンプレートDNA1μLの試薬組成でAcrAB,oxyRのプロモーターを大量に複製した

＜PCR試薬組成＞ PrimerF 1.5μL PrimerR 1.5μL dNTPs 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL テンプレートDNA (DH5α,JM109) 1μL MgSO4 4μL H2O 31μL KOD-Plus- 1μL total 50μL

＜設定＞ Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 94℃ 94℃ 62.8℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 20sec 2min 保持 35サイクル

Results

(1)　8月21日(土)のPCR試薬組成(2)で電気泳動をしたところ、

　　AcrAB(DH5α)

　　AcrAB(JM109)

　　oxyR(DH5α)

　　oxyR(JM109)

それぞれでバンドが確認できなかった

(2)　翌日pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)は培養が成功していたので、

後日使うまで、冷蔵保存しておいた

(3)　詳しい結果は23日(2)に掲載した

August 23

Time

9:00～21:00

Member

岩城,竹内,中村,臼井,吉村

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Yoshimura

Title

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる　[吉村]　

(2)　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック　[中村、臼井]

(3)　dps,acrABのDNA濃度測定　[中村、臼井]

Purpose

1. The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
2. PCR of dps,AcrAB,trxC,and OxyR.And Comfirm those by agarose gel electrophoresis.[Nakamura,Usui]
3. Measurement of density of DNA of dps and acrAB.[Nakamura,Usui]

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

(2)　活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック

(3)　dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

　30％ H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくった

　↓4M H2O2(250μl)とミリQ(750μl)で1MのH2O2をつくった

　↓以下10倍希釈していき、1nM H2O2まで作成した

　次にDH5αのシングルコロニーをピックアップした

　↓LB(-amp)2mlでプレカルチャーを行った

　↓(37℃でインキュベート、overnight)

(2)　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック

　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCRを以下の組成、設定で行った

＜組成＞ (dps,grxA,trxC) (oxyR) PrimerR 1.5μL PrimerR 3μL PrimerF 1.5μL PrimerF 3μL dNTP 5μL dNTP 20μL Buffer 5μL Buffer（KOD－FX） 50μL DNA（DH5α） 0.5μL DNA（DH5α） 2μL MgSO4 4μL MilliQ 20μL MilliQ 31.5μL KOD－FX 2μL KOD－Plus 1μL 全量 50μL 全量 100μL

＜PCRの設定＞ (dps,grxA ,trxC) (oxyR) 1．Pre　Penature 94℃―2min 94℃―2min 2．Denature 94℃―15sec 94℃―10sec 3．Annealing 59.7℃―30sec 52℃―30sec 4．Extension 68℃―30sec 68℃―45sec 5．+Extension 68℃ー2min 68℃ー2min またPCR後、それぞれ電気泳動によるチェックを以下の条件で行った 　1回目　100V、20min　EtBr　20min 　2回目　135V、15min　EtBr　10min

(3)　dps,acrABのDNA濃度測定

　吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった

Results

(1)　実験結果は25日のノートに記載した

(2)　1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった

2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった

＊詳細は写真参照

(3)　吸光度の測定結果

以下の吸光度の結果から、PCRが十分と判断された

吸光度	dps	acrAB
1回目	0.340	0.565
2回目	0.329	0.555
3回目	0.314	0.556
4回目	0.309	0.556
5回目	0.312	0.551
平均値	0.321	0.557

August 24

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Time

9:00～21:00

Member

岩城,竹内,中村,臼井,吉村

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Yoshimura

Purpose

1. The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
2. Confirmation of PCR products(dps and AcrAB) by Agarose gel electrophoresis.[Nakamura,Usui]
3. Dps and AcrAB digestion by restriction enzymes.[Nakamura,Usui]

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる(2日目)　[吉村]

(2)　dps、acrABの電気泳動によるPCRの確認　[中村、臼井]

(3)　dps、acrABの制限酵素処理　[中村、臼井]

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる(2日目)

　前日にプレカルチャーしたLB 2 mlにLB(-amp)(2ml)を加え濃度調整、濁度を計った

　↓O.D.600=0.4~0.6まで培養することを目的とした

　　10:00　O.D.600=0.310

　　11:30　O.D.600=0.908　(濁度が高すぎたため、この溶液5mlをLB20mlに植え継ぎ培養しなおした)

　　11:50　O.D.600=0.152

　　13:00　O.D.600=0.502　(目的の濃度に達したため、培養を停止した)

　↓培養後、2mlずつ分注し、それぞれにH2O2を加えた

　↓加えた後、37℃で1時間培養した

　↓培養後、LB1mlに培養液をそれぞれ1μlずつ分注し、その内10μlをLBプレートにまいた

　↓37℃でインキュベートを行った(overnight)

(2)　dps、acrABの電気泳動

　前日にPCRしておいたdps、acrAB(50μL×2本ずつ)を電気泳動し、EtBr処理の後、写真を撮影した

　その条件を以下に示す

＜条件＞

DNA 10μL

1％アガロースゲルで135V、15min

EtBr処理　10min

(3)　dps、acrABの制限酵素処理

　PCR後のdps、acrABをライゲーション用に制限酵素処理を行った

　制限酵素処理の組成を以下に示す

＜組成＞

DNAsol　40μL

1×H．Buffer　5μL

EcoRⅠ　1μL

SpeⅠ　1μL

H₂O　3μL

これを、37℃で3.5hインキュベートした後、冷蔵保存した

Results

(1)　実験結果は25日に記載

(2)　薄いバンドが目的の位置に確認された

＊詳細は写真参照

(3)　制限酵素処理済のdps、acrABは25日にライゲーションを行う予定

August 25

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Time

9:00～21:00

Member

岩城,古道,竹内,吉村

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Yoshimura

Purpose

1. The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
2. The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
3. Pre-culture of pSB1A2(I13507) , pSB1A2(E0430) and pSB1A2(J22005).[Furumichi]
4. Transform pSB1A2(I13507) and pSB1A2(E0420) into the competent cells.[Furumichi]
5. Ligation of AcrAB-pSB6A1(K121013) and dps-pSB6A1(K121013).[Iwaki,Takeuchi]
6. DNA miniprep pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),pSB1AK3(I732950) and pSB4A5(K193602).[Iwaki,Takeuchi]

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる(3日目)　[吉村]

(2)　大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)　[吉村]

(3)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー　[古道]

(4)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をDH5αに形質転換　[古道]

(5)　dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation　[岩城、竹内]

(6)　pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),

pSB1AK3(I732950),pSB4A5(K193602)のプラスミド抽出　[岩城、竹内]

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

　プレートにコロニーが生えているか確認し、コロニーの数を数えた

(2)　過酸化水素の浸透性を利用し、大腸菌の生存曲線を調べる

　実験(1)でcontrolのプレートにコロニーが生えなかったので、違った方法でプレートを作成した

　DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで培養した

　↓培養後、LB1mlに対して、培養液を1ml加えて希釈した

　↓希釈した培養液10μlをLBプレートにまき、37℃で1時間インキュベートした

　↓1時間後、過酸化水素水をLBプレートの中心に20μl滴下し、

　　滴下した過酸化水素水がLBプレートに完全に浸透するまで待った

　↓完全に浸透したのを確認し、37℃でインキュベートした(overnight)

(3)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー

　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)の

　コロニーをピックアップしLB液体培地(+amp)に入れた

　↓37℃で振とう培養した

(4)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420),をDH5αに形質転換

　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をそれぞれ1µl取り、そこにDH5α 100µlを加え混ぜた

　↓氷上、30min

　↓42℃で45秒間、熱ショックを与えた

　↓氷上、2min

　↓SOC培地0.9mlを加えた

　↓37℃で1時間振とう培養した

　↓400µlずつLB(+amp)プレートに播いて37℃でインキュベートした(overnight)

(5)　dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation

EcoRⅠ-SpeⅠで制限酵素処理したdps,AcrABと EcoRⅠ-XbaⅠで制限酵素処理したpSB6A1(K121013)に電気泳動を行い、 ゲル抽出、ライゲーションを行った dpsは前日(24日)に制限酵素処理したものを用いた ↓pSB6A1(K121013)の制限酵素処理を行った ↓右表に従い試薬を混合し、37℃で30分間インキュベートした ↓CIAP 1μLを加えて、37℃で30分間インキュベートした ↓dpsとpSB6A1(K121013)それぞれにOrange Loading Dyeを10μLずつ加え、 　30μずつ、レーンにアプライした ↓ゲルのレーンには左2列にpSB6A1(K121013)を、右2列にdpsを流した

＜試薬組成＞ DNAsol 30μL M buffer 5μL EcoRⅠ 1μL XbaⅠ 1μL H2O 13μL 全量 50μL

(6)　大量培養後のアルカリミニプレップ

　以下の5種類のベクターを用意した

　　　　pSB3K3(J04450)

　　　　pSB6A1(K121013)

　　　　pSB1A2(E0240)

　　　　pSB1AK3(I732950)

　　　　pSB4A5(K193602)

　菌液をチューブに入る量だけ入れた

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を捨てた後、菌液を更に追加した

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓以上の操作を菌液がなくなるまで繰り返した

　↓solⅠ 4mLを加え、vortexした

　↓solⅡ 200μLを加えon ice 5min.

　↓solⅢを150μL加えon ice 5min.

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓イソプロパノール400μL(等量)を加えた

　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した

　↓70%EtOHを200μL加えた

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓遠心乾燥を行った

　↓これをTE(RNase)30μLに溶解し、冷蔵保存した

Results

(1)　コロニー数を数えて以下の表にまとめた

H2O2濃度	0mM(control)	100nM	10nM	1nM	100pM	10pM	1pM
コロニー数	0	7	147	59	0	144	289

controlのプレートになぜかコロニーが生えなかった

この実験では大腸菌をプレートにまく作業を７回繰り返したため、時間差が生じてしまったのが原因とみられる

とにかくcontrolプレートに大腸菌が生えなければどうしようもないので、この結果は不採用とした

(2)　8月26日に結果を記載した

(3)　三本ともプレカルチャーが成功したため、8月27日の実験で使用した

(4)　pSB1A2(I13507) ,pSB1A2(E0420)のトランスフォーメーションは成功した

よって、8月27日の実験で使用することになった

(5)　ゲル抽出に移る前にdpsのバンドが十分量検出できなかったため、

ゲル抽出、およびLigationを行うことができなかった

pSB6A1(K121013)のバンドははっきりと見えたが、濃度としては不十分だった

(6)　すべてのプラスミドの濃度が低かった

August 26

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Time

9:00～

Member

岩城,竹内,中村,臼井,足立

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Adachi

Purpose

1. The survivorship curve of E. coli　is examined.[Adachi]
2. pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005) and pSB1A2(I13507) digestion by restriction enzymes.And confirm by Agarose gel electrophoresis.[Usui]
3. PCR of SodA.[Usui]

(1)　大腸菌の生存曲線を調べ(2日目)、生存曲線を作成　[足立]

(2)　前日にアルカリミニプレップした

pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)を制限酵素で処理、処理の確認(電気泳動)　[臼井]

(3)　SodAのプロモーターをPCRによって増幅　[臼井]

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

　前日まいたコロニーの数を数え、今までのデータを統計、生存曲線を作成した

(2)　pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)の制限酵素処理

右表の組成で制限酵素処理を行い、37℃で1時間インキュベートした 　↓電気泳動を以下の方法で行った 　　　　1×ladderをマーカーとし、一番左のコームに流した 　　　　↓Loading Buffer1μLに対し 　　　　　pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)をぞれぞれ5μLの割合で加え左から 　　　　　2∼4番目にpSB1A2(E0430)、 　　　　　5~7番目にpSB1A2(J22005)、 　　　　　8番目(右端)にpSB1A2(I13507)をそれぞれコームに流した 　↓結果を写真撮影した

＜組成＞ EcoRⅠ lμL PstⅠ 1μL プラスミドDNA 5μL 10×H Buffer 2μL H2O 11μL 全量 20μL

(3)　SodAのPCR処理

下表の組成でテンプレートDNAにDH5αを使用したものを2本(DH5α-1,DH5α-2)、 JM109を使用したものを2本(JM109-1,JM109-2)作製した ↓以下のプログラムでPCR処理を行った	＜PCR試薬の組成＞ SodA PrimerF 1.5μL PrimerR 1.5μL dNTPs 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL テンプレートDNA (DH5α,JM109) 0.5μL MgSO4 4μL H2O 31.5μL KOD-Plus- 1μL total 50μL
Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 94℃ 94℃ 62.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル

Results

(1)　計測した結果を以下にまとめた

[H2O2]	0mM	1nM	10nM	100nM	1μM	10μM	100μM	1mM	10mM	100mM
コロニー数	231	220	165	133	109	80	31	1	0	0

これを元に、大腸菌の生存曲線を作成した

以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断した

図17Bは、大腸菌XL-ブルーおよびO-112a,c血清型の生存能力に対するH2O2の濃度依存的毒性を示す <引用文献> 　桂川国際特許事務所 [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html 「抗体または好中球を介するオゾン生成」]

(2)　pSB1A2(E0430)はすべてバンドが見えたので、

バンドの一番濃かった左から4番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)

pSB1A2(J22005)は左から6番目と7番目がバンドが見えたので、

7番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)

RFP(I13507)はバンドが現れなかった

(3)　PCR処理を行った4つ全てについてSodAが十分量含まれていることが27日(金)の電気泳動によりわかった

August 27

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9:00～

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福山,竹内,臼井

Fukuyama,Takeuchi,Usui

Purpose

1. DNA miniprep of psB6A1(K121013).[Takeuchi]
2. Making of EtBr.[Takeuchi]

(1)　psB6A1(K121013)のミニプレ　[竹内]

(2)　エチジウムブロマイドの作成　[竹内]

Method

(1)　psB6A1(K121013)のミニプレ

　psB6A1(K121013)24mL分を分注した

　↓遠心1分(20℃、14500rpm)して集菌し、エッペン2本分にした

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓遠心5分(4℃、14000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓MilliQを30μl加えた

　↓二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した

　　Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した

　　(マーカーは1kbp radderを使用した)

　　↓100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色

　　↓泳動結果を写真で撮影した

(2)　エチジウムブロマイドの作成

MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液(0.44mg/mL)を1滴加えた

Results

(1)　十分に濃いバンドが確認できた

これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる

(2)　1滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに3滴付加したところ十分に使用できるようになった

Consideration

(1)　次回からは100倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき

(2)　これより40mL分を作る時は少なくとも4滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる

August 28

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Time

9:00～

Member

岩城,竹内,中村,臼井,革島

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Kawashima

Purpose

1. Making of primer mix of AcrAB,dps,SodA and OxyR.[Takeuchi,Usui]
2. PCR of AcrAB and OxyR.[Iwaki]
3. PCR of dps and hemH.[Usui]
4. Agarose gel electrophoresis of dps and hemH.[Iwaki]
5. DNA miniprep of pSB1A2(E0420) and pSB1A2(I13522).[Nakamura]
6. Agarose gel electrophoresis of pSB1A2(E0420) and pSB1A2(I13522).[Nakamura]

(1)　AcrAB,dps,SodA,OxyRのプライマーミックス(PM)の作成　[竹内、臼井]

(2)　AcrAB,oxyRのPCR　[岩城]

(3)　dps,hemHのPCR　[臼井]

(4)　dps,hemHの電気泳動　[岩城]

(5)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ　[中村]

(6)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動　[中村]

Method

(1)　Primer MIXの作成

　AcrAB,dps,SodA,OxyRのPrimerF,PrimerRそれぞれ10μLずつを80μLのH2Oに溶解し、

　全量100μL、10pmol/μLにした溶液(PrimerMIX)を作成した

(2)　AcrAB,oxyRのPCR

＜PCR試薬組成＞ AcrAB oxyR PrimerF 1.5μL 1.5μL dNTPs 5μL 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL 5μL テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL MgSO4 4μL 4μL H2O 33μL 33μL KOD-Plus- 1μL 1μL total 50μL 50μL

＜設定＞ Pre Denature 94℃ 2min 35Cycles↓ 　Denature 94℃ 15sec 　Annealing 62.8℃ 30sec 　Extension 68℃ 30sec +Extension 68℃ 2min 4℃ ∞

(3)　dps,hemHのPCR

＜PCR試薬組成＞ dps hemH PrimerF 1.5μL 1.5μL dNTPs 5μL 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL 5μL テンプレートDNA(DH5α) 0.5μL 0.5μL MgSO4 4μL 4μL H2O 33μL 33μL KOD-Plus- 1μL 1μL total 50μL 50μL

＜設定＞ Pre　Denature 94℃ 2min 35Cycles↓ 　Denature 94.0℃ 15sec 　Annealing 60.0℃ 30sec 　Extension 68.0℃ 30sec +Extension 68.0℃ 2min 4℃ ∞

(4)　dps,hemHの電気泳動　

　(3)のPCRの後、増幅を確認するために電気泳動にかけ、写真撮影を行った

　諸条件を以下に示す

＜条件＞

　DNA量　　5μL

　電気泳動　100V　30min

　EtBr処理　20min

(5)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ

　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)について同様の操作を行った

　培養後の培養液1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した

　↓4℃、14,000rpm、5min遠心

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)

　↓5min on ice

　↓4℃、14,000rpm、10min遠心

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、14,000rpm、20min遠心

　↓70％EtOHを200μL加える

　↓4℃、14,000rpm、10min遠心

　↓30sec　遠心乾燥

　↓TE30μL加えてプラスミドDNAとした

(6)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動

　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ後、電気泳動を行いチェックした

＜条件＞

　DNA量　5μL

　電気泳動　100V　20min

　EtBr処理　20min

Results

(1)　今回作成したPMは今後使用していく予定

(2)　後日電気泳動により増幅の確認を行う

(3,4)　hemH、dpsに関してははっきりとバンドが見え、増幅が確認された

(5,6)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)共に明瞭なバンドが確認された

　＊詳細は写真参照

Remarks

(3,4)SpeⅠが届き次第、制限酵素処理を行う

(5,6)pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のプレートからシングルコロニーをピックアップして、LB培地(1)で培養