Team:KIT-Kyoto/Notebook-week1

August 15

Time

9:00～18:00

Member

坂田(15:00∼),臼井,革島,中村,吉村

Sakata,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura

Purpose

1. Miniprep pSB3K3(J04450)

2. Digested these and Ran on a Gel

・pSB1A2(J44000)

・pSB3K3(J04450)

(1)　pSB3K3(J04450)のアルカリミニプレップ

(2)　pSB1A2(J44000)及びpSB3K3(J04450)が大腸菌に挿入されているかどうか制限酵素処理によって確認する

Method

(1)　pSB3K3(J04450)のアルカリミニプレップ

　培養後のpSB3K3(J04450)を1.5mLエッペンチューブに取った

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した

　↓5min on ice

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、15,000rpm、20min遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを捨てた

　↓30sec　遠心乾燥した

　↓RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした

(2)pSB1A2(J44000)及びpSB3K3(J04450)のカットチェック

＜組成＞ pSB1A2 5μL pSB3K3 5μL EcoRⅠ 1μL EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL PstⅠ 1μL Buffer(H) 1μL Buffer(H) 1μL H2O 11μL H2O 11μL 計 20μL 計 20μL

これを1h,37℃でインキュベートした 　↓Loading Buffer　1μLを加えたものと、 　　マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gelのコームに流し込んだ 　↓100V,30min泳動した 　↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した 　↓泳動結果を写真で撮影した

Results

(1)　抽出したプラスミドを冷蔵保存した

(2)　pSB1A2

　→4つ中2番にバンドが確認された。

　　　2番（プレカルチャーしておいたもの）にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した

(3)　pSB3K3

　→4つ中1，2番の2本にバンドが確認された

　　　LB培地（kan+）2mLを加え、振とう培養した

Consideration

(1)　翌日、制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する

(2)　翌日以降、培養を続けプラスミドを大量に回収する

August 14

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Time

9:00～17:00

Member

岩城,竹内,臼井,吉村

Iwaki,Takeuchi,Usui,Yoshimura

Purpose

1. Digested pSB1A2(J44000) and Ran on a Gel

2. Miniprep pSB1A2(J44000)

3. Preculture pSB3K3(J04450)

(1)　制限酵素処理によって目的プラスミドpSB1A2(J44000)の挿入を確認する

(2)　pSB1A2(J44000)のアルカリミニプレップをする

(3)　PSB3K3(J04450)のシングルコロニーをピックアップする

Method

(1)　pSB1A2(J44000)の電気泳動

(2)　pSB1A2(J44000)のアルカリミニプレップ

(3)　PSB3K3(J04450)のプレカルチャー

Result

(1)　バンドが検出できなかった

(2)　抽出したプラスミドを冷蔵保存した

(3)　一晩、LB(+Kan)培地で培養した

Consideration

(1,2)　DNaseの混入の可能性が考えられる

(3)　　翌日、プラスミドを抽出し目的プラスミドの挿入を確認する

August 13

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Time

9:00～21:00

Member

岩城,竹内,中村,吉村,足立

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Yoshimura,Adachi

Purpose

1. pSB3K3 transformed into the competent cells(DH5Alpha) convincingly onto a LB(+kan) plate.
2. Miniprep pSB1A2(J44000),pSB6A1(J04450) from 12/8
3. Digested these and Ran on a Gel

• pSB1A2(J44000)
• pSB6A1(J04450)

(1)　12日にLB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする

(2)　前日に培養したpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のプラスミド抽出

(3)　DH5αに目的プラスミドpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)が挿入されているか制限酵素処理をすることによって確かめる

Method

(1)　pSB3K3(J04450)のトランスフォーメーション

　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した

　↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した

　↓on　ice　30min

　↓45℃で45sec、過熱した

　↓on　ice　2min

　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた

　↓37℃で1h、振とう培養した

　↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight

(2)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のミニプレップ

　培養後のpSB1A2(J44000)とpSB6A1(J04450)を1.5mLチューブに取った

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)

　↓5min on ice

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した

　↓上澄みを捨てた

　↓30秒間遠心乾燥を行った

　↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした

(3)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)の制限酵素処理と電気泳動

pSB1A2(J44000) pSB6A1(J04450) XbaⅠ,PstⅠ 1μL - EcoRⅠ,SpeⅠ - 1μL (2)で得たpSB1A2 プラスミド 5μL - (2)で得たpSB6A1 プラスミド - 5μL H2O 11μL 11μL H Buffer 1μL 2μL M Buffer 1μL - 計 20μL 20μL

右の組成で1.5mlチューブ内で混合した 37℃で1時間インキュベートした ↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した 　(マーカーは1kbp radderを使用した) ↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した ↓泳動結果を写真で撮影した

Result

(1)　　2つのコロニーの生育を確認した(ピンク)

(2,3)　pSB6A1(J04450)→2本のバンドが確認できたことにより、目的プラスミドの挿入が確認できた

　pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった

Consideration

(1)

(2,3)　翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る

　翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う

August 11

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Time

9:00～21:00

Member

岩城,福山,竹内,臼井,足立

Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Adachi

Purpose

1. pSB6A1(J04450)and pSB1A2(J44000) transformed into the competent cells(DH5Alpha)[Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Adachi]

(1)　iGEM本部から送られてきたプラスミドを増やすために大腸菌に形質転換する[岩城,福山,竹内,臼井,足立]

Method

(1)　pSB6A1(J04450)及びpsB1A2(J44000)のトランスフォーメーション

　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した

　↓DH5α 100 μLを2本のチューブに分注した

　↓それぞれのチューブにpSB6A1(J04450)、psB1A2(J44000)を1 μL加えた

　↓on　ice　30min

　↓45℃で45sec、ヒートショックを行った

　↓on　ice　2min

　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた

　↓37℃で1h、振とう培養した

　↓全量をLBプレート(+amp)に撒き、37℃で一晩培養した

Results

(1)　翌日、シングルコロニーの生育が確認できた

Consideration

(1)　生育が確認できたら、シングルコロニーをピックアップし液体培地で培養する

August 12

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Time

9:00～18:00

Member

岩城,福山,竹内,臼井,足立

Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Adachi

Title

1. Preculture pSB6 and psB1

2. Digested pGVBptt and Ran on a Gel

3. psB3K3(J04450) transformed into the competent cells(DH5Alpha)

(1)　pSB6及びpsB1(非パーツ)のプレカルチャー

(2)　pGVBpttの電気泳動

(3)　psB3K3(J04450)のトランスフォーメーション

Purpose

(1)　pSB6A1(K121013)及びpsB1(非パーツ)のプレカルチャー

(2)　pGVBpttが正しく制限酵素処理されているかどうかを確認するため

(3)　psB3K3(J04450)のトランスフォーメーション

Method

(1)　pSB6及びpsB1(非パーツ)のプレカルチャー

　DH5α-pSB6,DH5α-pSB1をそれぞれ液体LB培地(+amp)2mLで培養した

(2)　pGVBpttの電気泳動

＜組成＞ pGVBppt 5μL KpmI 1μL HindⅢ 1μL Buffer M 1μL H2O 11μL 計 20μL

これを37℃で1時間インキュベートした ↓Loading Buffer 1μLを加えたものとマーカー(1kbp radder)を 　1% Agarose Gelのコームに流し込んだ ↓100Vで30分間泳動した ↓EtBr(10mg/mL)で20分間染色した ↓泳動結果を写真で撮影した

(3)　psB3K3(J04450)のトランスフォーメーション

　psB3K3にSOCを0.9mL加え、DH5αにトランスフォーメーションした

　↓37℃でインキュベートした(Overnight)