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October 10
No experiments.
October 11
Time
- 9:00~
Member
- 福山、竹内
- Fukuyama,Takeuchi
Purpose
- DNA digestion of pSB6A1(ahpC,GFP) by restriction enzymes and isolation of DNA fragments from agarose gel and ligation and transformation. [Fukuyama]
- (1) pSB6A1(ahpC,GFP)の制限酵素処理、ゲルを使ったDNA抽出、ライゲーション、トランスフォーメーション [福山]
- ベクター ：pSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)
- インサート：ahpC+GFP(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)
Method
- (1) 表1のとおりに調製し、37℃で1時間インキュベートした
- ↓2つあった表1の試料を合わせて、全量を200 μlにした
- ↓MilliQを450 μl,酢酸ナトリウムを50 μl加え、
- さらにフェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた
- ↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
- ↓上清を回収し、そこにイソプロパノールを800 μl加えた
- ↓20分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを500 μl加えた
- ↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓沈殿をMilliQ 20 μlにとかし、Orange -loading dyeを5 μl加え、電気泳動を行った
- ↓バンドを切り出して、MilliQを400 μl加えた
- ↓フェノールを等量加え、ボルテックス
- ↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
- ↓上清を回収した
- ↓フェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス
- ↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
- ↓上清を回収し、ベクターであるpSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)
- の入ったエッペンドルフチューブに入れた(ベクターの正確な量はわからない)
- ↓イソプロパノールをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた
- ↓20分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
- ↓上清を捨てた
- ↓70%エタノールを500 μl加えた
- ↓5分間遠心した(4℃、14,500 rpm)
- ↓上清を捨てた
- ↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた
- ↓16℃に30分間置いた
- ↓DH5α懸濁液を100 μl加えた
- ↓氷上に30分間置いた
- ↓42℃に30分間置いた
- ↓氷上に2分間置いた
- ↓soc培地を900 μl加えた
- ↓37℃で1時間振とう培養した
- ↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した
- ↓37℃で一晩インキュベートした
| 表1: 制限酵素処理 |
| 単位はμl |
| DNA溶液 | 88 |
| EcoRⅠ | 1 |
| PstⅠ | 1 |
| Buffer H | 10 |
| 全量 | 100 |
Results
- 特に結果として記すものはなかった
October 12
Time
Member
- 竹内
- Takeuchi
Purpose
- Picking up single colony of pSB1C3(ahpC,GFP).[Takeuchi]
- (1) pSB1C3(ahpC,GFP)のシングルコロニーのピックアップ
Results
- (1) pSB1C3(ahpC,GFP)のシングルコロニーのピックアップ
- 前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが2つ見られたのでピックアップし、
それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、
午前中から夕方までは37℃で振とう培養し、夕方からはovernightで室温で振とう培養した
Results
- (1) 特に結果として示せるものはなかった
October 13
Time
- 12:00~
Member
- 福山
- Fukuyama
Purpose
- DNA miniprep of pSB1C3(ahpC,GFP) and concentration.[Fukuyama]
- Concentrate of pSB1C3(ahpC)[Fukuyama]
- (1) pSB1C3(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップと濃縮
- (2) pSB1C3(ahpC)の濃縮
【実験方法】
- (1) pSB1C3(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップと濃縮
- LB液体培地で培養したpSB1C3(ahpC,GFP)を遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
- ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
- ↓上清を新しいチューブに移した
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
- ↓カラムにMilliQを100 μl加えた
- ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
- ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
- ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
- ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓TE20 μl加えた
- ↓このうち10 μlとり、別のエッペンドルチューブにいれた
- (2) pSB1C3(ahpC)の濃縮
- ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
- ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*2)
- ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
- ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓TE20 μl加えた
- ↓このうち10 μlとり、別のエッペンドルチューブにいれた
Results
- (1) 濃度は測らなかったが、(*1)を終えたところで、DNAと思われる沈殿が観察された
- (2) 濃度は測らなかったが、(*2)を終えたところで、DNAと思われる沈殿が観察された
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