Team:KIT-Kyoto/Notebook-week8

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	Sun	Mon	Tue	Wed	Thu	Fri	Sat
Week1	-	-	-	08-11-2010	08-12-2010	08-13-2010	08-14-2010
Week2	08-15-2010	08-16-2010	08-17-2010	08-18-2010	08-19-2010	08-20-2010	08-21-2010
Week3	08-22-2010	08-23-2010	08-24-2010	08-25-2010	08-26-2010	08-27-2010	08-28-2010
Week4	08-29-2010	08-30-2010	08-31-2010	09-01-2010	09-02-2010	09-03-2010	09-04-2010
Week5	09-05-2010	09-06-2010	09-07-2010	09-08-2010	09-09-2010	09-10-2010	09-11-2010
Week6	09-12-2010	09-13-2010	09-14-2010	09-15-2010	09-16-2010	09-17-2010	09-18-2010
Week7	09-19-2010	09-20-2010	09-21-2010	09-22-2010	09-23-2010	09-24-2010	09-25-2010
Week8	09-26-2010	09-27-2010	09-28-2010	09-29-2010	09-30-2010	10-01-2010	10-02-2010
Week9	10-03-2010	10-04-2010	10-05-2010	10-06-2010	10-07-2010	10-08-2010	10-09-2010
Week10	10-10-2010	10-11-2010	10-12-2010	10-13-2010	-	-	-

September 26

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Time

9：00～

Member

福山,臼井,革島,中村

Fkuyama,Usui,Kawashima,Nakamura

Purpose

DNA miniprep of promoter less RFP and pSB1C3 and digestion by restriction enzymes.[Kawashima]
Digestion of pSB6A1 with promoter by restriction enzymes.[Nakamura]
Isolation of pSB1C3 from agarose gel.[Fukuyama]
GFP fluorescent strength measurement of ahpC and sufA.[Usui]

(1)　promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理　[革島]

(2)　各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理　[中村]

(3)　pSB1C3のゲル抽出　[福山]

(4)　ahpC,sufAの蛍光強度測定実験　[臼井]

Method

(1)　promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理

　＊ミニプレ

　　　9/15カラム不使用のミニプレ参照

　　　最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした

　＊制限酵素処理

　　　pSB1C3：DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、pstⅠ1μL用い、Total　25μLで処理した(8本)

　　　promoter less RFP：DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、XbaⅠ1μL用い、Total　25μLで処理した(3本)

(2)　各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理

　各プロモーター(acrAB、ahpC、dps、oxyR、sodA、sufA、yaiA)

　の入ったpSB6A1をE-Pcutした(Overnight)

表1: 制限酵素処理試薬組成
	acrAB	ahpC	dps	oxyR	sodA	sufA	yaiA
DNAsol	8.8μL	5.5μL	8.56μL	7.1μL	6.96μL	8.7μL	6.2μL
EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL
10xH	2.5μL
Milli Q	Final　25μLに調整

(3)　pSB1C3のゲル抽出

　4種類の濃度（3589.8ng/μlが1試料,2393.2ng/μlが3試料,1196.6ng/μlが2試料,598.3ng/μlが1試料）

　pSB1C3計7試料(全量はそれぞれ50 μl)に3 μlずつCIAPを加えた

　↓前日に作成した1％青ゲルを使って100Vで25分間電気泳動した

　　確認のため、同時に各試料5 μlずつとって1％アガロースゲルを使って135Vで15分間電気泳動した

　↓確認のための電気泳動でバンドが確認できたので、バンドが見えなかった青ゲルをさらにEtBrで20分間染色した

　↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した

　↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた

　↓フェノールを430 μlほど加えた

　↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）

　↓上清を回収

　↓フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、vortex

　↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）

　↓上清を回収

　↓酢酸ナトリウムを50 μlずつ、イソプロパノールを800 μlずつ加えた

　↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）

　↓上清を捨て、70％エタノールを500 μlずつ加えた

　↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓TEを11 μlずつ加えた

　↓冷凍庫で保存

(4)　ahpC,sufAの蛍光強度測定実験

　菌液濁度(O.D.₆₀₀)を0.4~0.6に調整した

　↓終濃度がlessおよび1nM～1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した

　↓37℃でインキュベートし、10分ごとに菌液500μLずつ回収した

　↓cfg.4℃ 14,000rpm,1min

　↓上清を除いた

　↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した

　↓全量を蛍光強度測定に用いた

　　※この操作を80分まで行った

Results

(1)

表2: 濁度測定
	RFP 1	RFP 2	RFP 3	RFP 4	RFP 5	RFP 6	RFP 7	pSB1C3
OD₂₆₀	0.753	0.589	0.756	0.505	0.503	0.517	0.456	0.570
DNA濃度	18825	14725	18825	12625	12591	12925	11400	14250
全量	28	29	29	29	29	29	29	29

(2)明日、ゲル抽予定

(3)吸光度をまだ測っていないので、ゲル抽出が上手くいったのかはわからない

Consideration

(1)　問題なく実験はうまくいった

(3)　今までも、青ゲルを使った抽出のための電気泳動で、バンドが見えないことがあったようだが、

今回のように EtBr染色し、UVにあてるとバンドの存在が確認できるケースも結構あったのかもしれない。

(4)　29日の実験ノートに結果を添付

September 27

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Time

9：00～

Member

岩城、福山、古道、臼井、革島、中村、吉村

Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura

Purpose

DNA miniprep of dps＋GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFP and pSB1C3.[Furumichi]
Digestion of dps＋GFP, ahpC+GFP and AcrAB+GFP by restriction enzymes.[Furumichi]
Measurement of absorbance of pSB1C3.[Fukuyama]
Isolation of acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA,sufA,yaiA(on GFP+pSB6A1),pSB1C3 from agarose gel.[Fukuyama]
Ligation of pSB1C3-SufA+GFP,OxyR,SodA,yaiA and transform those into the competent cells.[Fukuyama]
GFP fluorescent strength measurement of TetR and K121013.[Usui,Nakamura]

(1)　前日培養しておいた、dps＋GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFP, pSB1C3のミニプレップ　[古道]

(2)　(1)でミニプレップ処理をしたdps＋GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFPの制限酵素処理　[古道]

(3)　9月26日の(3)の続き　―　pSB1C3のゲル抽出後の吸光度測定　[福山]

(4)　acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA,sufA,yaiA(いずれもon GFP+pSB6A1),pSB1C3のゲル抽出　[福山]

(5)　ベクターpSB1C3,インサートSufA+GFP,OxyR,SodA,yaiAのライゲーションとトランスフォーメーション　[福山]

(6)　TetR,K121013の蛍光強度測定　[臼井、中村]

Method

(1)　前日培養しておいた、dps＋GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFP, pSB1C3のミニプレップ

　1.5mlエッペンチューブに集菌

　↓SolutionⅠを100µl加えボルテックスし常温で5分放置

　↓SolutionⅡを200µl加え混ぜ氷上に5分放置(これ以降はボルテックスをしない)

　↓SolutiionⅢを150µl加え混ぜ氷上に5分放置

　↓cfg　4℃、15,000rpm、5分

　↓上清を回収しそれに100％エタノールを1ml加え混ぜた

　↓常温10分放置

　↓cfg　4℃、15,000rpm、12分

　↓上清を捨て沈殿に70％エタノールを500μl加えた

　↓cfg　4℃、15,000rpm、3分

　↓エタノールを除き2分遠心乾燥させた

　↓RNase入りTEを30µl加え溶解した

　↓各吸光度を測定した

(2)　(1)でミニプレップ処理をしたdps＋GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFPの制限酵素処理

　以下の組成に従い制限酵素処理を行った

　↓37℃、一晩、インキュベートした

表1: 制限酵素処理
	dps	AcrAB	ahpC
DNA	20μl	20μl	15µl
Buffer　H	5µl	5µl	5µl
H₂O	23µl	23µl	28μl
XbaⅠ	1µl	1µl	1µl
PstⅠ	1µl	1µl	1µl

(3)　pSB1C3のゲル抽出後の吸光度測定

　9月26日の(3)で得たpSB1C3の7試料(各試料の全量11 μl)をそれぞれ1 μlとって100倍希釈で吸光度測定を行った

(4)　acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA,sufA,yaiA(いずれもon GFP+pSB6A1),pSB1C3のゲル抽出

　acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA,sufA,yaiA(いずれもon GFP+pSB6A1),pSB1C3それぞれに5倍希釈で

　Loading Bufferを加えた

　↓それぞれを低融点アガロース1%ゲルにアプライし、50Vで1時間電気泳動した

　↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した

　↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた

　↓フェノールを430 μlほど加えた

　↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）

　↓上清を回収

　↓フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、vortex

　↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）

　↓上清を回収

　↓酢酸ナトリウムを50 μlずつ、イソプロパノールを800 μlずつ加えた

　↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）

　↓上清を捨て、70％エタノールを500 μlずつ加えた

　↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓pSB1C3(*1)にTEを10 μl加えて溶かし、この溶液をSufAにいれて溶かした→溶液(*2)

　OxyRにTEを10 μl加えて溶かし、この溶液をpSB1C3(*2)にいれて溶かした→溶液(*3)

(5)　下表1の通りに溶液を調整した

　↓16℃で30分間インキュベートした

　↓各試料にDH5α懸濁液150 μlずつ加えた

　↓氷上で3分放置

　↓43℃下に30秒置いた

　↓soc培地を900 μlずつ加えた

　↓集菌してクロラムフェニコール入りのLB寒天培地にまいた

　↓37℃,overnightでインキュベート

表2: 試薬組成(単位は μl)
	試料1	試料2	試料3	試料4	試料5
pSB1C3	(*2)全量	(*3)全量	0.5	2	1
Suf+GFP	(*2)全量	0
OxyR		(*3)全量	3.9
yaiA				5.6
SodA					9
MilliQ			5.6	2.4
2xLigation Mix	10	10	10	10	10
全量	20	20	20	20	20

(6)　TetR,K121013の蛍光強度測定

　菌液濁度(O.D.₆₀₀)を0.4~0.6に調整した

　↓終濃度がlessおよび1nM～1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した

　↓37℃でインキュベート

　　※10分ごとに菌液500μLずつ回収した

　↓cfg.4℃ 14,000rpm 1min

　↓上清を除いた

　↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した

　↓全量を蛍光強度測定に用いた

　※この操作を90分まで行った

Results

(1)

表3: 吸光度結果
1/100	dps	AcrAB	ahpC
1回目	1.242	1.570	2.616
2回目	1.173	1.595	2.538
3回目	1.167	1.516	2.531
4回目	1.168	1.389	2.533
5回目	1.169	1.394	2.512
平均	1.1838	1.4928	2.546
濃度	5919(ng/µl)	7464(ng /µl)	12730(ng/µｌ)

(2)次回に正しくcutされているのかを電気泳動で確認する

(3)吸光度測定(260nm)の結果を表4に示した。

但し、試料8は１回測定した後、間違えて希釈した試料を捨ててしまった

また、前日の実験(3)では7つの試料であったが、

切り出したゲルを10個のエッペンに分けて入れたので、今回は試料数が10になっている

表4: 吸光度(1/100)
	試料1	試料2	試料3	試料4	試料5	試料6	試料7	試料8	試料9	試料10
1回目	0.024	0.017	0.009	0.054	0	0.059	0.081	0.006	0.016	0.015
2回目	0.017	0.021	0.011	0.056	0.003	0.067	0.086		0.013	0.007
3回目	0.017	0.013	0.012	0.054	0.006	0.06	0.078		0.015	0.012
4回目	0.017	0.018	0.013	0.061	0.004	0.061	0.078		0.015	0.009
5回目	0.018	0.014	0.014	0.06	0	0.063	0.083		0.019	0.008
平均	0.019	0.0166	0.0118	0.057	0.0026	0.062	0.0812	0.006	0.0156	0.0102
濃度(ng/μl)	93	83	59	285	13	310	406	30	78	51

(4)　acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodAを電気泳動したゲルを粉砕してしまったので、DNAのゲル抽出はできなかった

sufA,yaiA,pSB1C3に関してはDNAのゲル抽出ができた

吸光度測定(260nm)の結果を表に示した

表5: 吸光度測定結果(1/100)
	SufA	pSB1C3 (EcoRⅠとPstⅠでcut)	yaiA
1回目	0.041	0.034	0.07
2回目	0.039	0.033	0.069
3回目	0.04	0.034	0.068
平均	0.04	0.0344	0.069
濃度(ng/μl)	200	172	345

(5)　明日、コロニーができているかを確認する

(6)　29日実験ノートに添付

Consideration

(3)　100倍希釈で吸光度が0.010より小さい値を示した試料5と試料8はとても薄く、

誤差の範囲(ゼロ補正に使ったMilliQでも出うる値)なので、使い物にはならないと思われる

(4)　低融点アガロースゲルは非常にもろく壊れやすいので、持ち運びに細心の注意が必要

September 28

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Time

9：00～

Member

福山、古道、吉村

Fukuyama,Furumichi,Yoshimura

Purpose

Agarose gel electrophoresis of dps+GFP,AcrAB+GFP,ahpC+GFP.[Furumichi]
Digestion of sufA by restriction enzymes.[Furumichi]
Isolation of pSB6A1(promoterless,RFP),OxyR,AcrAB from agarose gel.[Fukuyama]
Digestion of pSB6A1(AcrAB,GFP),pSB6A1(ahpc,GFP),pSB6A1(OxyR,GFP),pSB6A1(SodA,GFP),pSB6A1 (SufA,GFP),pSB6A1 (yaiA,GFP),pSB6A1 (dps,GFP) by restriction enzymes.[Fukuyama]
Picking up single colony of pSB1C3(OxyR),pSB1C3(SodA).[Fukuyama]

(1)　前日制限酵素処理したdps+GFP,AcrAB+GFP,ahpC+GFPのカットチェック　[古道]

(2)　sufAの制限酵素処理　[古道]

(3)　pSB6A1(プロモーターレス,RFP),OxyR,AcrABのゲルを使ったDNA抽出　[福山]

(4)　pSB6A1(AcrAB,GFP),pSB6A1(ahpc,GFP),pSB6A1(OxyR,GFP),pSB6A1(SodA,GFP),

pSB6A1 (SufA,GFP),pSB6A1 (yaiA,GFP),pSB6A1 (dps,GFP)のEcoRⅠとPstⅠを使った制限酵素処理　[福山]

(5)　pSB1C3(OxyR),pSB1C3(SodA)のシングルコロニーのピックアップ　[福山]

Method

(1)　前日制限酵素処理したdps+GFP,AcrAB+GFP,ahpC+GFPのカットチェック

　前日制限酵素処理したdps+GFP,AcrAB+GFP,ahpC+GFPを電気泳動した

(2)　sufAの制限酵素処理

　12615(ng/μl)のsufAを以下の組成の通りに制限酵素処理をした

　↓37℃、一晩、インキュベートした

表1: 制限酵素処理
DNA	10μl
Buffer H	5μl
H₂O	8.5μl
EcoRⅠ	1μl
SpeⅠ	0.5μl
total	25μl

(3)　pSB6A1(プロモーターレス,RFP),OxyR,AcrABのゲルを使ったDNA抽出

　EcoRⅠとXbaⅠで制限酵素処理をしたpSB6A1(プロモーターレス,RFP)がそれぞれ100 μg入っている

　6つの試料に、CIAPを3 μlずつ加え、37℃で30分置いた

　↓CIAP処理を終えたpSB6A1(プロモーターレス,RFP)、

　　EcoR１とSpe１で制限酵素処理をしたOxyRとAcrABを1％アガロースゲルを用いて、50Vで50分間電気泳動した

　↓EtBrで20分間染色

　↓UVを照射し、ゲルを切り出した(pSB6A1(プロモーターレス,RFP)は2つのエッペンチューブにわけて回収した

　↓MilliQをそれぞれ400 μl 加えた

　↓60℃に7分ほど置いて、ゲルを溶かした

　↓フェノールを、エッペンチューブに入っているゲルとMilliQの合計量ほど加え、かるく混ぜた

　↓25℃, 13000 rpm で5分間遠心した

　↓上清を回収し、フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、ボルテックス

　↓25℃, 13000 rpm で5分間遠心した

　↓上清を回収した

　↓酢酸ナトリウムを50 μl、イソプロパノールを800 μl加え混ぜた

　↓4℃, 14500 rpm で10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを500 μl加えた

　↓4℃, 14500 rpm で5分間遠心した

　↓上清を捨てた

　↓乾燥させた

　↓pSB6A1(プロモーターレス,RFP)は、エッペンチューブ1本あたり11 μlのTEに溶かした

　　そのうちの1μlはMilliQで100倍希釈して、吸光度を測定したOxyRとAcrABはそれぞれ20 μlのTEに溶かした

(4)　EcoRⅠとPstⅠを使った制限酵素処理

　表2の通りにDNA溶液に制限酵素,バッファーとMilliQを加えて、

　それぞれ全量が25 μlになるようにした(DNAはそれぞれ約100 μgになっている)

　↓overnightで37℃に置いた

表2：制限酵素試薬組成
単位はμl	試料1	試料2	試料3	試料4	試料5	試料6	試料7
AcrAB	9
ahpc		6
dps			9
OxyR				7
SodA					7
SufA						9
yaiA							6
EcoRⅠ	1	1	1	1	1	1	1
pstＩ	1	1	1	1	1	1	1
buffer H	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
Milli Q	11.5	14.5	1.5	13.5	13.5	11.5	14.5
合計	25	25	25	25	25	25	25

(5)　DH5α: pSB1C3(OxyR),pSB1C3(SodA)のシングルコロニーのピックアップ

　27日の実験(5)で行ったトランスフォーメーションの結果、

　DH5α: pSB1C3(OxyR)

　　　　pSB1C3(SodA)

　のみコロニーが確認できたので、それぞれDH5α(pSB1C3(OxyR))は16個、

　DH5α(pSB1C3(SodA))は1個のコロニーをクロラムフェニコール入りのLB寒天培地にストリークし、37℃に置いた

Results

(1)　それぞれ検出されたバンドの大きさは以下に記した通りになった

　　　dps　　→　約4kbp,約3kbp,約2kbp

　　　AcrAB　→　約4kbp,約2kbp

　　　ahpC　 →　約2kbp,約1kbp

(2)　結果は次回DNA抽出し吸光度を測定した際に見る

(3)　ゲル抽出済pSB6A1(プロモーターレス,RFP)の吸光度結果(100倍希釈)

表3: 吸光度測定結果
1/100	RFP(プロモーターレス)1	RFP(プロモーターレス)2
1回目	0.006	0.013
2回目	0.008	0.008
3回目	0.006	0.010
4回目	0.007	0.008
5回目	0.008	0.010
平均	0.007	0.0098
濃度	35(ng/μl)	49(ng/μl)

DNA濃度は十分になかった

(4)　制限酵素を反応させるまでの作業であったので、特に結果として挙げられるものはなかった

(5)　ピックアップしたコロニーが、本当に正しくライゲーションできているのかわからない

少なくとも、明日確認した時、

ストリークしたDH5αの部分が赤紫色になっているものは制限酵素処理の時点で失敗しているものである

Consideration

(1)　dps ,AcrABに関してはDNAの大きさが理想と異なる

AcrABのDNAの長さは327bpと小さいものであるため今回の結果のような大きなDNAのバンドが検出されることはない

対しahpCは理想のDNAの大きさに近いものが検出されたためahpCは実験に使用可能のものといえる

(3)　DNA濃度が十分になかった理由としてはゲルの切り出しが甘かったためと思われる

September 29

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Time

9：00～

Member

福山、臼井、中村、吉村

Fukuyama,Usui,Nakamura,Yoshimura

Purpose

Isolation of acrAB,oxyR,sufA(promoter only),sufA,yaiA,acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA(on K121013) from agarose gel.Fukuyama,Yoshimura]
GFP fluorescent strength measurement of TetR and K121013.[Usui,Nakamura]
Cultivate of pSB1C3(OxyR),pSB1C3(SodA).[Fukuyama]
Ligation and transformation.[Fukuyama]

(1)　acrAB,oxyR,sufA(いずれもプロモーターのみ)

sufA,yaiA,acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA(on K121013)のゲルからのDNA抽出　[福山、吉村]

(2)　TetR,K121013の蛍光強度測定　[臼井、中村]

(3)　pSB1C3(OxyR),pSB1C3(SodA)のLB液体培地への植菌　[福山]

(4)　ライゲーション、トランスフォーメーション　[福山]

　ベクター：EcoRⅠとXbaⅠで切断したpSB6A1(プロモーターレス,RFP)

　インサート：EcoRⅠとSpeⅠで切断したOxyRとAcrAB

Method

(1)　ゲルからのDNA抽出

　平常通りゲル抽出をおこなったが、今回は低融点ゲルを用いず普通のアガロースゲルを用いてゲルの切り出しをした

　↓ゲルの重さを測り、ゲルの3倍量のBufferQGを入れた

　↓5分間50℃でヒートショック

　↓ゲルと等量のイソプロパノールを加え、カラムにアプライした

　↓10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた

　↓500μlのBufferQGを加えた

　↓10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた

　↓750μlのBufferPEを加えた

　↓10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた

　↓もう一度10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた

　↓カラムをエッペンに移し替え30μlのミリQを滴下した

　↓10,000rpm,4℃で1分間遠心した

(2)　TetR,K121013の蛍光強度測定

　菌液濁度(O.D.₆₀₀)を0.4~0.6に調整した

　↓終濃度がlessおよび1nM～1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した

　↓37℃でインキュベート

　　※10分ごとに菌液500μLずつ回収した

　↓cfg.4℃,14000rpm,1min

　↓上清を除いた

　↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した

　↓全量を蛍光強度測定に用いた

　※この操作を90分まで行った

(3)　DH5α(pSB1C3(OxyR)),DH5α(pSB1C3(SodA)) のLB液体培地への植菌

　28日にクロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した

　DH5α(pSB1C3(OxyR))とDH5α(pSB1C3(SodA))をクロラムフェミコールが入った3 mlのLB液体培地3セット分それぞれ植菌した

(4)　ライゲーション、トランスフォーメーション

　表1の通りに試料1、試料2をつくった

　　　pSB6A1(プロモーターレス,RFP)　→　17.6 ng/μl

　　　AcrAB　→　61 ng/μl

　　　OxyR　→　39 ng/μl

　↓16℃に30分間置いた

　↓氷上に30分間置いた

　↓DH5αの懸濁液を100 μlずつ加えた

　↓氷上に30分間置いた

　↓42℃に45秒置いた

　↓氷上に2分間置いた

　↓SOC培地を900 μlずつ加えた

　↓37℃で1時間振とう培養した

　↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地にまいた

表1: 試薬組成(単位はμl)
	試料1	試料2
pSB6A1(プロモーターレス,RFP)	9	7.8
AcrAB	1
OxyR		1.5
Milli Q		0.7
2xLigation Mix	10	10
合計	20	20

Results

(1)　sufA,yaiA,acrAB,ahpC,dps,oxyR(on K121013)はバンドが見えなかった

sodA(on K121013)は予想された位置とは違う場所にバンドが出た

acrAB,oxyR,sufA(いずれもプロモーターのみ)は切り出しに成功した

acrAB,oxyR,sufAの濃度は以下の通り

　　＊acrAB……39ng/μl(全量28μl)

　　＊oxyR……61ng/μl(全量28μl)

　　＊sufA……54.5ng/μl(全量58μl)

(2)　得られたデータは別のページにまとめた

>>プロモーター活性

(3)　今日は、培養できたかどうかまだ判断できなかった

(4)　成功していれば、明日コロニーが観察できると思われる

Consideration

(1)　バンドが見えなかったのはRNAが分解されていなかったためと思われる

これからはRNaseを入れた後に37℃のインキュベーターの中に30分間入れておくという操作が必要である

バンドが予想された位置に出なかった理由は不明

September 30

>>top

Time

9：00～

Member

岩城、竹内、中村

Iwaki,Takeuchi,Nakamura

Purpose

PCR of ahpC and sufA.[Iwaki]
Digestion of ahpC and sufA by restriction enzymes.[Iwaki]
Digestion of RFP(promoterless , on psB6A1) by restriction enzymes and agarose gel electrophoresis.[Takeuchi]
DNA miniprep of pSB6A1(K362008) and pSB6A1(K362012).[Iwaki]
DNA miniprep of oxyR、sodA(on pSB1C3).[Nakamura]

(1)　ahpC,sufAのPCR　[岩城]

(2)　ahpC,sufAの制限酵素処理　[岩城]

(3)　ミニプレ後のRFP(promoterless , on psB6A1)のカットチェック　[竹内]

(4)　pSB6A1(K362008)とpSB6A1(K362012)のミニプレップ　[岩城]

(5)　oxyR、sodA(on pSB1C3)のミニプレ　[中村]

Method

(1)　ahpC,sufAのPCR

　500μLエッペンに下表1の組成で溶液を加えた

　ahpC 2本、sufA 4本を調整した

　下表2のプログラムでPCR反応を行った

表1: 試薬組成
PM	0.75μl
鋳型DNA(DH5α 3)	0.25μl
10xPCR Buffer for KOD-Plus	2.5μl
2mM dNTPs	2.5μl
2mM MgSO₄	2.0μl
Milli Q	16.5μl
KOD-Plus-	0.5μl
全量	25μL

表2: PCRプログラム
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	(60.2)℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	∞
	30サイクル

　各サンプルから5μlとってローディングダイ1μlと混合して1%ゲルを用いて

　1kb Makerとともに100V、25minの条件で電気泳動した

　↓EtBrで30min染色した。

　↓UVを照射し、写真を撮影した

　↓サンプルをまとめた

　　sufA(total 60μl)、ahpC(total 40μl)から1μlとって100倍希釈して吸光度を測定した

(2)　ahpC,sufAの制限酵素処理

　ahpC,sufAの制限酵素処理

　(1)で増やしたahpC,sufAを制限酵素処理した

　組成は下表3の通り

　これらを37℃で1hインキュベートした

表3: 制限酵素処理試薬組成

ahpC(total 50 μl)
DNAsol	39 μl
EcoRⅠ	1 μl
SpeⅠ	0.5 μl
M buffer	5 μl
H₂O	4.5 μl

sufA(total 50 μl)
DNAsol	29.5 μl
EcoRⅠ	1 μl
SpeⅠ	0.5 μl
M buffer	5 μl
H₂O	14 μl

sufAC(total 50 μl)
DNAsol	29.5 μl
EcoRⅠ	1 μl
PstⅠ	1 μl
H buffer	5 μl
H₂O	13.5 μl

(3)　ミニプレ後のRFP(promoterless , on psB6A1)のカットチェック

　EcoRⅠ,XbaⅠで制限酵素処理した試料とミニプレ後の試料から各5μlとって

　ローディングダイ1μlと混合して1%ゲルを用いて1kb Makerとともに135v,20minの条件で電気泳動した

　↓EtBrで20min染色した

　↓UVを照射し、写真を撮影した

　↓各バンドを比較した

(4)　pSB6A1(K362008)とpSB6A1(K362012)のミニプレップ

　朝、植菌したpSB6A1(K362008)とpSB6A1(K362012)を遠心1分（25℃、14,500rpm）して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓室温5min

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓on ice 5min

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓on ice 5min

　↓遠心5分（25℃、14,500rpm）

　↓上清を新しいチューブに移した

　↓ΦOH/CIAAを200μl加えた

　↓遠心5分（4℃、15,000rpm）

　↓水層を新しいチューブに移した

　↓100%EtOHを1ml加えた

　↓室温で10min

　↓遠心12min(15,000rpm,4℃)

　↓上清を捨てた

　↓70%EtOHを加えた　　

　↓遠心3min(15,000rpm,4℃)

　↓上清を捨てた

　↓乾燥2min

　↓TE(RNase入り)を30μl加えた

　↓37℃で30minインキュベートした

　↓サンプルをまとめた

　↓サンプルを1μlとり、TEで100倍希釈して吸光度を計測した

(5)　oxyR、sodA（on pSB1C3）のアルカリミニプレップ

　＊手順は(4)と同様

　最終的に、oxyR(1xTE30μL)、sodA(1xTE30μL)、sodA(TE、RNase入30μL)の3種類を得た

　→RNaseを十分に働かせるため37℃で30minインキュベートした

　内、1μLを吸光度測定に用いた

Results

(1)　電気泳動の結果、sufAの2番のサンプルはバンドが検出できなかったので破棄した

残りのサンプルをまとめて計測した吸光度は以下であった

表4: 吸光度測定結果

ahpC	0.044
	0.051
	0.057
	0.058
	0.053
平均	0.0526
濃度	0.0526×100×50=263　ng/μl

sufA	0.060
	0.061
	0.057
	0.061
	0.061
平均	0.06
濃度	0.06×100×50=300 ng/μl

(2)　後日ゲル抽出を行い、ライゲーションに使用、その結果を参照

(3)　ミニプレ後の試料に関しては十分に濃いバンドを確認できたが、

制限酵素処理した試料に関してはバンドを確認することができなかった

(4)

表5: 吸光度測定結果

pSB6A1(K362008)
	2.643
	2.582
	2.578
	2.561
	2.568
平均	2.5864
濃度	12932 ng/μl

pSB6A1(K362012)
	2.560
	2.472
	2.411
	2.407
	2.411
平均	2.4522
濃度	12261 ng/μl

(5)

表6: 吸光度測定結果

oxyR on pSB1C3 (x1/300)	0.858
	0.905
	0.908
	0.918
	0.917
平均	0.9012
濃度	13500 ng/μl (未RNase処理)

sodA on pSB1C3 (1xTE)	0.953
	0.988
	1.066
	1.012
	1.026
平均	1.009
濃度	15135ng/μl (未RNase処理)

sodA on pSB1C3 (TE RNase入)	0.693
	0.684
	0.689
	0.694
	0.691
平均	0.6902
濃度	10353ng/μl (RNase処理済)

→これらを各1μLのEcoRⅠとPstⅠでカットした

Consideration

(1)　sufAの2番を除いてPCRは成功している、濃度も十分である

(3)制限酵素処理した試料を36時間以上、37℃インキュベーター内に入れておいたことが、

DNA消失の原因である可能性が高いと考えられる

今後、制限酵素処理が終わった試料はすみやかに冷凍庫へ入れるべきである。

(5)　カットチェックが完了していないので、断言はできないが、

RNaseの有無における吸光度の差異からTE RNaseの酵素活性は十分であると考えられる

October 1

>>top

Time

22:00～23:00

Member

岩城、竹内、臼井

Iwaki,Takeuchi,Usui

Puropose

Analysis of sequence of pSB1C3(ahpC).[Iwaki]
Digestion of K362008 ahpC GFP on psB6A1,K362012 sufA GFP on psB6A1 by restriction enzymes.[Takeuchi]

(1)　pSB1C3(ahpC promoter only)のシーケンスを読む　[岩城]

(2)　提出用ベクターにLigation するためのK362008 ahpC GFP on psB6A1,K362012 sufA GFP on psB6A1の制限酵素処理　[竹内]

Method

(1)　pSB1C3(ahpC promoter only)のシーケンスを読む

・シークエンス用のプライマーの調整をした

　注文したプライマーを150 μlのTEに溶かした

　↓これを1 μMにするためにMilli Qで100倍希釈した

・次にPCRのための試薬調整をした

　組成は以下の表のとおりとした

　pSB1C3(ahpC)のプラスミド抽出済み濃度は12730 ng/μlであった

　↓Milli Qで100倍希釈した

　　これを1 μl使用したので、DNA量は127.3 ng

　↓Milli Qの量は全量が10 μlになるように調整した

　↓プライマーFとRの2つのチューブを作成した

　↓以下の条件でPCRをかけた

表1: composition
Milli Q	4.4 μl
Premix	2 µl
5 sequence buffer	1 µl
Primer(1µM)	1.6 µl
Plasmid DNA	1 µl
Total	10 µl

表2: condition
	Cysles	Temperature(℃)	Time(min)
Step1	1	96	1:00
Step2	30	96	0:10
		50	0:05
		60	4:00
Step3	1	4	∞

(2)　提出用ベクターにLigation するためのK362008 ahpC GFP on psB6A1,K362012 sufA GFP on psB6A1の制限酵素処理

　K362008 ahpC GFP on psB6A1,K362012 sufA GFP on psB6A1のミニプレ後の試料に制限酵素処理した

　組成は以下の通り

　これらを37℃で8hインキュベートした

表3: 制限酵素処理試薬組成

K362008 ahpC GFP on psB6A1 (total 50 μl)
DNAsol	10 μl
EcoRⅠ	1 μl
PstⅠ	1 μl
H buffer	5 μl
H₂O	33 μl

K362012 sufA GFP on psB6A1 (total 50μl)
DNAsol	10 μl
EcoRⅠ	1 μl
PstⅠ	1 μl
H buffer	5 μl
H₂O	33 μl

Results

(1)　PCRが終わったものを冷凍保存した

(2)　10/2のゲル抽での電気泳動写真よりK362012 sufA GFP on psB6A1に関しては十分な制限酵素処理ができたと考えられるが、

K362012 sufA GFP on psB6Aに関してはバンドが非常に薄かったため、制限酵素処理が十分でなかった可能性がある

Consideration

(1)　10/3にシーケンスの読み取りの続きを行う

(2)　酵素を入れた後の十分なピペッテイングがされていなかった

酵素処理の時間が短かった可能性が考えられる

October 2

>>top

Time

6:00~8:40

Member

岩城、竹内、臼井

Iwaki,Takeuchi,Usui

Purpose

Measurement of absorbance of sufA(promoter only).[Usui]
Agarose gel electrophoresis of sufA and ahpC and isolation of DNA fragments from agarose gel.[Usui]

(1)　9月30日に保存されたsufA(promoter only)の濃度測定　[臼井]

(2)　sufA,ahpC(ともにE-P処理後)の電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出　[臼井]

Method

(1)　9月30日に保存されたsufA(promoter only)の濃度測定

　100倍希釈して吸光度の測定(五回の平均より求めた)

(2)　sufA,ahpC(ともにE-P処理後)の電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出

　全量の6倍希釈になるようにLoadong　Bufferをそれぞれ加えた

　↓1kbpマーカーとともに100V、30minで電気泳動

　↓ゲルの切り出し

　↓切りだしたゲルの重さを量った

　↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート。2,3分毎に振り混ぜた

　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓内5μLを濃度測定に使用した

　　(H₂Oを95μL加え20倍希釈とした)

Results

(1)sufA(promoter only)の吸光度と濃度を以下に纏めた

表1: 吸光度測定結果
一回目	0.031
二回目	0.034
三回目	0.044
四回目	0.020
五回目	0.019
Ave	0.0296
濃度	148ng/μL

(2)

表2: ゲル抽出後の吸光度と濃度

ahpC(E-P処理後)
一回目	0.019
二回目	0.021
三回目	0.022
四回目	0.018
五回目	0.018
Ave	0.0196
濃度	19.6ng/μL

sufA(E-P処理後)
一回目	0.009
二回目	0.011
三回目	0.015
四回目	0.015
五回目	0.010
Ave	0.012
濃度	12ng/μL

Consideration

(2)　カラム使用のゲル抽出のため濃度が薄くなってしまっている

電気泳動の際、ahpCに関してなぜかバンドが3本存在した。なぜかは不明

またRNase in TEに溶かしているにもかかわらず、写真にRNAが写っていた→RNase失活の疑い

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