Team:KIT-Kyoto/Notebook-week10

October 10

No experiments.

October 11

Time

9:00~

Member

福山、竹内

Fukuyama,Takeuchi

Purpose

1. DNA digestion of pSB6A1(ahpC,GFP) by restriction enzymes and isolation of DNA fragments from agarose gel and ligation and transformation. [Fukuyama]

(1)　pSB6A1(ahpC,GFP)の制限酵素処理、ゲルを使ったDNA抽出、ライゲーション、トランスフォーメーション　[福山]

　　　ベクター　：pSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)

　　　インサート：ahpC+GFP(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)

Method

(1)　表1のとおりに調製し、37℃で1時間インキュベートした

　↓2つあった表1の試料を合わせて、全量を200 μlにした

　↓MilliQを450 μl,酢酸ナトリウムを50 μl加え、

　　さらにフェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた

　↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)

　↓上清を回収し、そこにイソプロパノールを800 μl加えた

　↓20分間遠心した(20℃、14,500 rpm)

　↓上清を捨て、70%エタノールを500 μl加えた

　↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓沈殿をMilliQ 20 μlにとかし、Orange -loading dyeを5 μl加え、電気泳動を行った

　↓バンドを切り出して、MilliQを400 μl加えた

　↓フェノールを等量加え、ボルテックス

　↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)

　↓上清を回収した

　↓フェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス

　↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)

　↓上清を回収し、ベクターであるpSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)

　　の入ったエッペンドルフチューブに入れた(ベクターの正確な量はわからない)

　↓イソプロパノールをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた

　↓20分間遠心した(25℃、13,000 rpm)

　↓上清を捨てた

　↓70%エタノールを500 μl加えた

　↓5分間遠心した(4℃、14,500 rpm)

　↓上清を捨てた

　↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた

　↓16℃に30分間置いた

　↓DH5α懸濁液を100 μl加えた

　↓氷上に30分間置いた

　↓42℃に30分間置いた

　↓氷上に2分間置いた

　↓soc培地を900 μl加えた

　↓37℃で1時間振とう培養した

　↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した

　↓37℃で一晩インキュベートした

Results

　特に結果として記すものはなかった

October 12

Time

Member

竹内

Takeuchi

Purpose

1. Picking up single colony of pSB1C3(ahpC,GFP).[Takeuchi]

(1)　pSB1C3(ahpC,GFP)のシングルコロニーのピックアップ

Results

(1)　pSB1C3(ahpC,GFP)のシングルコロニーのピックアップ

　前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが2つ見られたのでピックアップし、

それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、 午前中から夕方までは37℃で振とう培養し、夕方からはovernightで室温で振とう培養した

Results

(1)　特に結果として示せるものはなかった

October 13

Time

12:00~

Member

福山

Fukuyama

Purpose

1. DNA miniprep of pSB1C3(ahpC,GFP) and concentration.[Fukuyama]
2. Concentrate of pSB1C3(ahpC)[Fukuyama]

(1)　pSB1C3(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップと濃縮

(2)　pSB1C3(ahpC)の濃縮

【実験方法】

(1)　pSB1C3(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップと濃縮

　LB液体培地で培養したpSB1C3(ahpC,GFP)を遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた

　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)

　↓上清を新しいチューブに移した

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓カラムを新しいエッペンに移し替えた

　↓カラムにMilliQを100 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた

　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)

　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた

　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓TE20 μl加えた

　↓このうち10 μlとり、別のエッペンドルチューブにいれた

(2)　pSB1C3(ahpC)の濃縮

　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた

　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*2)

　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた

　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓TE20 μl加えた

　↓このうち10 μlとり、別のエッペンドルチューブにいれた

Results

(1)　濃度は測らなかったが、(*1)を終えたところで、DNAと思われる沈殿が観察された

(2)　濃度は測らなかったが、(*2)を終えたところで、DNAと思われる沈殿が観察された