Team:KIT-Kyoto/Notebook-week3

From 2010.igem.org

(Difference between revisions)
Line 2: Line 2:
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td>
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td>
[[Team:KIT-Kyoto|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Note|Notebook]] > [[Team:KIT-Kyoto/Notebook|Lab Note]] > [[Team:KIT-Kyoto/Notebook-week3|Week3]]</td></tr></table>
[[Team:KIT-Kyoto|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Note|Notebook]] > [[Team:KIT-Kyoto/Notebook|Lab Note]] > [[Team:KIT-Kyoto/Notebook-week3|Week3]]</td></tr></table>
-
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td width="165px" valign="top" align="left"><div>
+
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td width="165px" valign="top" align="left"><div>{{Template:KIT-Kyoto/menu1}}
-
{{Template:KIT-Kyoto/menu1}}
+
</div></td><td width="800px" valign="top" align="left"><div id="MIGI">
-
</div></td><td width="800px" valign="top" align="left"><div style="padding:3px;">
+
{{Template:KIT-Kyoto/Labdaily}}
{{Template:KIT-Kyoto/Labdaily}}
{{Template:KIT-Kyoto-Augsut22}}
{{Template:KIT-Kyoto-Augsut22}}

Revision as of 15:47, 11 October 2010



Home > Notebook > Lab Note > Week3

Sun
Mon
Tue
Wed
Thu
Fri
Sat
Week1
-
-
-
08-11-201008-12-201008-13-201008-14-2010
Week208-15-201008-16-201008-17-201008-18-201008-19-201008-20-201008-21-2010
Week308-22-201008-23-201008-24-201008-25-201008-26-201008-27-201008-28-2010
Week408-29-201008-30-201008-31-201009-01-201009-02-201009-03-201009-04-2010
Week509-05-201009-06-201009-07-201009-08-201009-09-201009-10-201009-11-2010
Week609-12-201009-13-201009-14-201009-15-201009-16-201009-17-201009-18-2010
Week709-19-201009-20-201009-21-201009-22-201009-23-201009-24-201009-25-2010
Week809-26-201009-27-201009-28-201009-29-201009-30-201010-01-201010-02-2010
Week910-03-201010-04-201010-05-201010-06-201010-07-201010-08-201010-09-2010
Week1010-10-201010-11-201010-12-201010-13-2010
-
-
-

August 22

Time

9:00~

Member

古道、臼井、中村、足立
Furumichi,Usui,Nakamura,Adachi

Title

(1) PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動 [足立、臼井]
(2) pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のプレカルチャー [臼井]
(3) AcrAB,oxyRのPCR [臼井]

Purpose

  1. Agarose gel electrophoresis of AcrAB and OxyR.[Adachi,Usui]
  2. Pre-culture of pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950).[Usui]
  3. PCR of AcrAB and OxyR.[Usui]
(1) PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック
(2) pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)の培養
(3) AcrAB,oxyRのPCR

Method

(1) PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動
 8月21日(土)にPCRで複製したAcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を
 各4本ずつ計12本電気泳動を行うことによりPCR産物の複製の程度を調べた
 AcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を
 各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した
 ↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った
 ↓EtBr(10mg/ml)で20分間染色した
 ↓泳動結果を写真撮影した
※結果は写真参照
(2) pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー
 プレート培地上からpSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のシングルコロニーをピックアップした
 ↓各2本ずつ、3mLの液体LB培地(+amp)を使用し、37℃で振とう培養した(overnight)
(3) AcrAB,oxyRのPCR
 AcrAB,oxyRに関して8月21日の実験結果より
 以下のようにMg4μL、テンプレートDNA1μLの試薬組成でAcrAB,oxyRのプロモーターを大量に複製した
<PCR試薬組成>
PrimerF1.5μL
PrimerR1.5μL
dNTPs5μL
KOD-Plus- Buffer5μL
テンプレートDNA
(DH5α,JM109)
1μL
MgSO44μL
H2O31μL
KOD-Plus-1μL
total50μL
<設定>
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃62.8℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec20sec2min保持
35サイクル

Results

(1) 8月21日(土)のPCR試薬組成(2)で電気泳動をしたところ、
  AcrAB(DH5α)
  AcrAB(JM109)
  oxyR(DH5α)
  oxyR(JM109)
それぞれでバンドが確認できなかった
(2) 翌日pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)は培養が成功していたので、
後日使うまで、冷蔵保存しておいた
(3) 詳しい結果は23日(2)に掲載した

August 23

Time

9:00~21:00

Member

岩城,竹内,中村,臼井,吉村
Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Yoshimura

Title

(1) 大腸菌の生存曲線を調べる [吉村] 
(2) dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック [中村、臼井]
(3) dps,acrABのDNA濃度測定 [中村、臼井]

Purpose

  1. The survivorship curve of E. coli is examined. [Yoshimura]
  2. PCR of dps,AcrAB,trxC,and OxyR.And Comfirm those by agarose gel electrophoresis.[Nakamura,Usui]
  3. Measurement of density of DNA of dps and acrAB.[Nakamura,Usui]
(1) 大腸菌の生存曲線を調べる
(2) 活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック
(3) dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。

Method

(1) 大腸菌の生存曲線を調べる
 30% H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくった
 ↓4M H2O2(250μl)とミリQ(750μl)で1MのH2O2をつくった
 ↓以下10倍希釈していき、1nM H2O2まで作成した
 次にDH5αのシングルコロニーをピックアップした
 ↓LB(-amp)2mlでプレカルチャーを行った
 ↓(37℃でインキュベート、overnight)
(2) dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック
 dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCRを以下の組成、設定で行った
<組成>
(dps,grxA,trxC)(oxyR)
PrimerR1.5μLPrimerR3μL
PrimerF1.5μLPrimerF3μL
dNTP5μLdNTP20μL
Buffer5μLBuffer(KOD-FX)50μL
DNA(DH5α)0.5μLDNA(DH5α)2μL
MgSO44μLMilliQ20μL
MilliQ31.5μLKOD-FX2μL
KOD-Plus1μL
全量50μL全量100μL
<PCRの設定>
(dps,grxA ,trxC)(oxyR)
1.Pre Penature94℃―2min94℃―2min
2.Denature94℃―15sec94℃―10sec
3.Annealing59.7℃―30sec52℃―30sec
4.Extension68℃―30sec68℃―45sec
5.+Extension68℃ー2min68℃ー2min


またPCR後、それぞれ電気泳動によるチェックを以下の条件で行った
 1回目 100V、20min EtBr 20min
 2回目 135V、15min EtBr 10min

(3) dps,acrABのDNA濃度測定
 吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった

Results

(1) 実験結果は25日のノートに記載した
(2) 1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった
2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった
*詳細は写真参照
(3) 吸光度の測定結果
以下の吸光度の結果から、PCRが十分と判断された
吸光度dpsacrAB
1回目0.3400.565
2回目0.3290.555
3回目0.3140.556
4回目0.3090.556
5回目0.3120.551
平均値0.3210.557

August 24

Time

9:00~21:00

Member

岩城,竹内,中村,臼井,吉村
Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Yoshimura

Purpose

  1. The survivorship curve of E. coli is examined. [Yoshimura]
  2. Confirmation of PCR products(dps and AcrAB) by Agarose gel electrophoresis.[Nakamura,Usui]
  3. Dps and AcrAB digestion by restriction enzymes.[Nakamura,Usui]
(1) 大腸菌の生存曲線を調べる(2日目) [吉村]
(2) dps、acrABの電気泳動によるPCRの確認 [中村、臼井]
(3) dps、acrABの制限酵素処理 [中村、臼井]

Method

(1) 大腸菌の生存曲線を調べる(2日目)
 前日にプレカルチャーしたLB 2 mlにLB(-amp)(2ml)を加え濃度調整、濁度を計った
 ↓O.D.600=0.4~0.6まで培養することを目的とした
  10:00 O.D.600=0.310
  11:30 O.D.600=0.908 (濁度が高すぎたため、この溶液5mlをLB20mlに植え継ぎ培養しなおした)
  11:50 O.D.600=0.152
  13:00 O.D.600=0.502 (目的の濃度に達したため、培養を停止した)
 ↓培養後、2mlずつ分注し、それぞれにH2O2を加えた
 ↓加えた後、37℃で1時間培養した
 ↓培養後、LB1mlに培養液をそれぞれ1μlずつ分注し、その内10μlをLBプレートにまいた
 ↓37℃でインキュベートを行った(overnight)
(2) dps、acrABの電気泳動
 前日にPCRしておいたdps、acrAB(50μL×2本ずつ)を電気泳動し、EtBr処理の後、写真を撮影した
 その条件を以下に示す
<条件>
DNA 10μL
1%アガロースゲルで135V、15min
EtBr処理 10min
(3) dps、acrABの制限酵素処理
 PCR後のdps、acrABをライゲーション用に制限酵素処理を行った
 制限酵素処理の組成を以下に示す
<組成>
DNAsol 40μL
1×H.Buffer 5μL
EcoRⅠ 1μL
SpeⅠ 1μL
H2O 3μL
これを、37℃で3.5hインキュベートした後、冷蔵保存した

Results

(1) 実験結果は25日に記載
(2) 薄いバンドが目的の位置に確認された
*詳細は写真参照
(3) 制限酵素処理済のdps、acrABは25日にライゲーションを行う予定

August 25

Time

9:00~21:00

Member

岩城,古道,竹内,吉村
Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Yoshimura

Purpose

  1. The survivorship curve of E. coli is examined. [Yoshimura]
  2. The survivorship curve of E. coli is examined. [Yoshimura]
  3. Pre-culture of pSB1A2(I13507) , pSB1A2(E0430) and pSB1A2(J22005).[Furumichi]
  4. Transform pSB1A2(I13507) and pSB1A2(E0420) into the competent cells.[Furumichi]
  5. Ligation of AcrAB-pSB6A1(K121013) and dps-pSB6A1(K121013).[Iwaki,Takeuchi]
  6. DNA miniprep pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),pSB1AK3(I732950) and pSB4A5(K193602).[Iwaki,Takeuchi]
(1) 大腸菌の生存曲線を調べる(3日目) [吉村]
(2) 大腸菌の生存曲線を調べる(1日目) [吉村]
(3) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー [古道]
(4) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をDH5αに形質転換 [古道]
(5) dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation [岩城、竹内]
(6) pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),
pSB1AK3(I732950),pSB4A5(K193602)のプラスミド抽出 [岩城、竹内]

Method

(1) 大腸菌の生存曲線を調べる
 プレートにコロニーが生えているか確認し、コロニーの数を数えた
(2) 過酸化水素の浸透性を利用し、大腸菌の生存曲線を調べる
 実験(1)でcontrolのプレートにコロニーが生えなかったので、違った方法でプレートを作成した
 DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで培養した
 ↓培養後、LB1mlに対して、培養液を1ml加えて希釈した
 ↓希釈した培養液10μlをLBプレートにまき、37℃で1時間インキュベートした
 ↓1時間後、過酸化水素水をLBプレートの中心に20μl滴下し、
  滴下した過酸化水素水がLBプレートに完全に浸透するまで待った
 ↓完全に浸透したのを確認し、37℃でインキュベートした(overnight)
(3) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー
 pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)の
 コロニーをピックアップしLB液体培地(+amp)に入れた
 ↓37℃で振とう培養した
(4) pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420),をDH5αに形質転換
 pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をそれぞれ1µl取り、そこにDH5α 100µlを加え混ぜた
 ↓氷上、30min
 ↓42℃で45秒間、熱ショックを与えた
 ↓氷上、2min
 ↓SOC培地0.9mlを加えた
 ↓37℃で1時間振とう培養した
 ↓400µlずつLB(+amp)プレートに播いて37℃でインキュベートした(overnight)
(5) dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation

EcoRⅠ-SpeⅠで制限酵素処理したdps,AcrABと
EcoRⅠ-XbaⅠで制限酵素処理したpSB6A1(K121013)に電気泳動を行い、
ゲル抽出、ライゲーションを行った

dpsは前日(24日)に制限酵素処理したものを用いた
↓pSB6A1(K121013)の制限酵素処理を行った
↓右表に従い試薬を混合し、37℃で30分間インキュベートした
↓CIAP 1μLを加えて、37℃で30分間インキュベートした
↓dpsとpSB6A1(K121013)それぞれにOrange Loading Dyeを10μLずつ加え、
 30μずつ、レーンにアプライした

↓ゲルのレーンには左2列にpSB6A1(K121013)を、右2列にdpsを流した
<試薬組成>
DNAsol30μL
M buffer5μL
EcoR1μL
Xba1μL
H2O13μL
全量50μL
(6) 大量培養後のアルカリミニプレップ
 以下の5種類のベクターを用意した
    pSB3K3(J04450)
    pSB6A1(K121013)
    pSB1A2(E0240)
    pSB1AK3(I732950)
    pSB4A5(K193602)
 菌液をチューブに入る量だけ入れた
 ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
 ↓上清を捨てた後、菌液を更に追加した
 ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
 ↓以上の操作を菌液がなくなるまで繰り返した
 ↓solⅠ 4mLを加え、vortexした
 ↓solⅡ 200μLを加えon ice 5min.
 ↓solⅢを150μL加えon ice 5min.
 ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
 ↓イソプロパノール400μL(等量)を加えた
 ↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
 ↓70%EtOHを200μL加えた
 ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
 ↓遠心乾燥を行った
 ↓これをTE(RNase)30μLに溶解し、冷蔵保存した
Results
(1) コロニー数を数えて以下の表にまとめた
H2O2濃度0mM(control)100nM10nM1nM100pM10pM1pM
コロニー数07147590144289
controlのプレートになぜかコロニーが生えなかった
この実験では大腸菌をプレートにまく作業を7回繰り返したため、時間差が生じてしまったのが原因とみられる
とにかくcontrolプレートに大腸菌が生えなければどうしようもないので、この結果は不採用とした
(2) 8月26日に結果を記載した
(3) 三本ともプレカルチャーが成功したため、8月27日の実験で使用した
(4) pSB1A2(I13507) ,pSB1A2(E0420)のトランスフォーメーションは成功した
よって、8月27日の実験で使用することになった
(5) ゲル抽出に移る前にdpsのバンドが十分量検出できなかったため、
ゲル抽出、およびLigationを行うことができなかった
pSB6A1(K121013)のバンドははっきりと見えたが、濃度としては不十分だった
(6) すべてのプラスミドの濃度が低かった

August 26

Time

9:00~

Member

岩城,竹内,中村,臼井,足立
Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Adachi

Purpose

  1. The survivorship curve of E. coli is examined.[Adachi]
  2. pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005) and pSB1A2(I13507) digestion by restriction enzymes.And confirm by Agarose gel electrophoresis.[Usui]
  3. PCR of SodA.[Usui]
(1) 大腸菌の生存曲線を調べ(2日目)、生存曲線を作成 [足立]
(2) 前日にアルカリミニプレップした
pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)を制限酵素で処理、処理の確認(電気泳動) [臼井]
(3) SodAのプロモーターをPCRによって増幅 [臼井]

Method

(1) 大腸菌の生存曲線を調べる
 前日まいたコロニーの数を数え、今までのデータを統計、生存曲線を作成した
(2) pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)の制限酵素処理

 右表の組成で制限酵素処理を行い、37℃で1時間インキュベートした
 ↓電気泳動を以下の方法で行った
    1×ladderをマーカーとし、一番左のコームに流した
    ↓Loading Buffer1μLに対し
     pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)をぞれぞれ5μLの割合で加え左から
     2∼4番目にpSB1A2(E0430)、
     5~7番目にpSB1A2(J22005)、
     8番目(右端)にpSB1A2(I13507)をそれぞれコームに流した

 ↓結果を写真撮影した
<組成>
EcoRlμL
Pst1μL
プラスミドDNA5μL
10×H Buffer2μL
H2O11μL
全量20μL
(3) SodAのPCR処理
下表の組成でテンプレートDNAにDH5αを使用したものを2本(DH5α-1,DH5α-2)、
JM109を使用したものを2本(JM109-1,JM109-2)作製した
↓以下のプログラムでPCR処理を行った
<PCR試薬の組成>
SodA
PrimerF1.5μL
PrimerR1.5μL
dNTPs5μL
KOD-Plus- Buffer5μL
テンプレートDNA
(DH5α,JM109)
0.5μL
MgSO44μL
H2O31.5μL
KOD-Plus-1μL
total50μL
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃62.2℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec1min2min保持
30サイクル
Results
(1) 計測した結果を以下にまとめた
[H2O2]0mM1nM10nM100nM1μM10μM100μM1mM10mM100mM
コロニー数2312201651331098031100

これを元に、大腸菌の生存曲線を作成した
0826-生存曲線.jpg

以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断した
0826-引用画像.jpg 図17Bは、大腸菌XL-ブルーおよびO-112a,c血清型の生存能力に対するH2O2の濃度依存的毒性を示す


<引用文献>
 桂川国際特許事務所
[http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html 「抗体または好中球を介するオゾン生成」]
(2) pSB1A2(E0430)はすべてバンドが見えたので、
バンドの一番濃かった左から4番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)
pSB1A2(J22005)は左から6番目と7番目がバンドが見えたので、
7番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)
RFP(I13507)はバンドが現れなかった
(3) PCR処理を行った4つ全てについてSodAが十分量含まれていることが27日(金)の電気泳動によりわかった

August 27

Time

9:00~

Member

福山,竹内,臼井
Fukuyama,Takeuchi,Usui

Purpose

  1. DNA miniprep of psB6A1(K121013).[Takeuchi]
  2. Making of EtBr.[Takeuchi]
(1) psB6A1(K121013)のミニプレ [竹内]
(2) エチジウムブロマイドの作成 [竹内]

Method

(1) psB6A1(K121013)のミニプレ
 psB6A1(K121013)24mL分を分注した
 ↓遠心1分(20℃、14500rpm)して集菌し、エッペン2本分にした
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μl加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ↓SolutionⅡを250μl加えた
 ↓SolutionⅢを350μl加えた
 ↓遠心5分(20℃、14500rpm)
 ↓上清をカラムに入れた
 ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 ↓遠心1分(20℃、14500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
 ↓抽出液を捨てた
 ↓滅菌水をカラムに入れた
 ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
 ↓溶出液を回収
 ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
 ↓遠心10分(4℃、14000rpm)
 ↓上清をすて、70%エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
 ↓遠心5分(4℃、14000rpm)
 ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
 ↓MilliQを30μl加えた
 ↓二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した
  Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
  (マーカーは1kbp radderを使用した)
  ↓100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
  ↓泳動結果を写真で撮影した
(2) エチジウムブロマイドの作成
MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液(0.44mg/mL)を1滴加えた

Results

(1) 十分に濃いバンドが確認できた
これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる
(2) 1滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに3滴付加したところ十分に使用できるようになった

Consideration

(1) 次回からは100倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき
(2) これより40mL分を作る時は少なくとも4滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる

August 28

Time

9:00~

Member

岩城,竹内,中村,臼井,革島
Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Kawashima

Purpose

  1. Making of primer mix of AcrAB,dps,SodA and OxyR.[Takeuchi,Usui]
  2. PCR of AcrAB and OxyR.[Iwaki]
  3. PCR of dps and hemH.[Usui]
  4. Agarose gel electrophoresis of dps and hemH.[Iwaki]
  5. DNA miniprep of pSB1A2(E0420) and pSB1A2(I13522).[Nakamura]
  6. Agarose gel electrophoresis of pSB1A2(E0420) and pSB1A2(I13522).[Nakamura]
(1) AcrAB,dps,SodA,OxyRのプライマーミックス(PM)の作成 [竹内、臼井]
(2) AcrAB,oxyRのPCR [岩城]
(3) dps,hemHのPCR [臼井]
(4) dps,hemHの電気泳動 [岩城]
(5) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ [中村]
(6) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動 [中村]

Method

(1) Primer MIXの作成
 AcrAB,dps,SodA,OxyRのPrimerF,PrimerRそれぞれ10μLずつを80μLのH2Oに溶解し、
 全量100μL、10pmol/μLにした溶液(PrimerMIX)を作成した
(2) AcrAB,oxyRのPCR
<PCR試薬組成>
AcrABoxyR
PrimerF1.5μL1.5μL
dNTPs5μL5μL
KOD-Plus- Buffer5μL5μL
テンプレートDNA(DH5α)1μL1μL
MgSO44μL4μL
H2O33μL33μL
KOD-Plus-1μL1μL
total50μL50μL
<設定>
Pre Denature94℃2min
35Cycles↓
 Denature94℃15sec
 Annealing62.8℃30sec
 Extension68℃30sec
+Extension68℃2min
4℃


(3) dps,hemHのPCR
<PCR試薬組成>
dpshemH
PrimerF1.5μL1.5μL
dNTPs5μL5μL
KOD-Plus- Buffer5μL5μL
テンプレートDNA(DH5α)0.5μL0.5μL
MgSO44μL4μL
H2O33μL33μL
KOD-Plus-1μL1μL
total50μL50μL
<設定>
Pre Denature94℃2min
35Cycles↓
 Denature94.0℃15sec
 Annealing60.0℃30sec
 Extension68.0℃30sec
+Extension68.0℃2min
4℃


(4) dps,hemHの電気泳動 
 (3)のPCRの後、増幅を確認するために電気泳動にかけ、写真撮影を行った
 諸条件を以下に示す
<条件>
 DNA量  5μL
 電気泳動 100V 30min
 EtBr処理 20min
(5) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ
 pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)について同様の操作を行った
 培養後の培養液1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した
 ↓4℃、14,000rpm、5min遠心
 ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
 ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
 ↓SolutionⅡ200μLを加え混合
 ↓5min on ice
 ↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
 ↓5min on ice
 ↓4℃、14,000rpm、10min遠心
 ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
 ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
 ↓4℃、14,000rpm、20min遠心
 ↓70%EtOHを200μL加える
 ↓4℃、14,000rpm、10min遠心
 ↓30sec 遠心乾燥
 ↓TE30μL加えてプラスミドDNAとした
(6) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動
 pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ後、電気泳動を行いチェックした
<条件>
 DNA量 5μL
 電気泳動 100V 20min
 EtBr処理 20min

Results

(1) 今回作成したPMは今後使用していく予定
(2) 後日電気泳動により増幅の確認を行う
(3,4) hemH、dpsに関してははっきりとバンドが見え、増幅が確認された
(5,6) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)共に明瞭なバンドが確認された
 *詳細は写真参照

Remarks

(3,4)SpeⅠが届き次第、制限酵素処理を行う
(5,6)pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のプレートからシングルコロニーをピックアップして、LB培地(1)で培養