Team:KIT-Kyoto/Protocol/Japanese

Protocol

液体培地の作製方法

LB液体培地(+amp)

LB液体培地(-amp)

2XYT培地

SOB培地

SOC培地

プレート培地の作製方法

LB液体培地(+amp)

LB液体培地(-amp)

1%アガロースゲルの作り方(4～5枚分)

PCR

アルカリミニプレップ

制限酵素処理

DNAのゲル抽出(QIAGEN kit使用)

ライゲーション

トランスフォーメーション

液体培地の作製方法

LB液体培地(+amp)

↓H₂O₂ 1LにBacto Tryptone　10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。

↓121℃20minでオートクレーブ。

↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml加えた。

LB液体培地(-amp)

↓H₂O₂ 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。

↓121℃20minでオートクレーブ。

2×YT培地

↓H₂O₂ 1LにBacto Tryptone 16g、Bacto Yeast Extract 10g、1M NaCl 5gを入れ、入れるごとに溶かした。

↓121℃20minでオートクレーブ。

SOB培地

↓H₂O₂ 1LにBacto Tryptone 20g、Bacto Yeast Extract 5g、

↓1M NaCl 5g、250mM KCl 10mg、5N NaOH 0.2mgを入れるごとに溶かした。

↓121℃20minでオートクレーブ。

↓触れられるぐらいの温度になったら1M MgCl₂ 10mg、1M MgSO₄ 10mg加えた。

SOC培地

↓H₂O₂ 1LにBacto Tryptone 20g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 5g、5N NaOH 0.2mgを入れるごとに溶かした。

↓121℃20minでオートクレーブ。

↓触れられるぐらいの温度になったら1Mグルコース　20mL、1M MgCl₂ 10mg、1M MgSO₄ 10mg加えた。

プレート培地の作製方法

LBプレート培地(+amp)

↓H₂O₂ 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。

↓121℃２０minでオートクレーブ。

↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。

LBプレート培地(-amp)

↓H₂O₂ 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。

↓121℃20minでオートクレーブ。

↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。

1%アガロースゲルの作り方(4～5枚分)

↓三角フラスコに量り取ったアガロース 1g、TAE100mLを加えた。

↓三角フラスコの口にラップをし、ラップに穴をあけてから浮遊物がなくなるまでレンジで加熱、10secごとに取り出し撹拌

↓アガロースゲルが触れる程度に冷えたら型をはめたゲル作成用の鋳型に分注（底の空気を出し、泡を潰した）

↓目的に応じたコームを差し込み、室温で放置し固めた

↓慎重にコームを抜きとり、作成したゲルを冷蔵庫に保存した

PCR

PCR反応

500μLエッペンに以下の組成で溶液を加えた。

Primer Mix・・・・・・・・・・・1.5μL

テンプレートDNA(　　　　　 )・・0.5μL

10×PCR Buffer for KOD-Plus-・・5μL

2mM d NTPs・・・・・・・・・・・5μL

2mM MgSO4 ・・・・・・・・・・・4μL

MilliQ・・・・・・・・・・・・・33μL

KOD-Plus- ・・・・・・・・・・・1μL

全量・・・・・・・・・・・・・・50μL

以下のプログラムでPCR反応を行った。

熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存

94℃ 94℃ (Tm-10)℃ 68℃ 68℃ 4℃

2min 15sec 30sec 1min/1kb ２min ∞

35サイクル

電気泳動によるPCR産物の確認

各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした。

↓1%アガロースゲルに＊と1kbpマーカー 3μLを添加した。

↓100V、15minで電気泳動した。

アルカリミニプレップ

• 試薬組成

• Buffer P1 (Suspension Buffer)

50mM Tris-HCl and 10mM EDTA, pH8.0(25℃)50μg/ml

• Buffer P2 (Lysis Buffer)

0.2M NaOH and 1%SDS

• Buffer N3 (Neutralization and Binding Buffer)

4M guanidine hydrochloride and 0.5M potassium acetate, pH4.2

• Buffer PB (Wash Buffer)

5M guanidine hydrochloride,20mM Tris-HCl, pH6.6 (25℃) [final concentrations after addition of ethanol]with 38% ethanol.

• Buffer PE (Wash Buffer)

20mM NaCl, 2mM Tris-HCl, pH7.5 (25℃) [final concentrations after addition of ethanol:widh 80% ethanol

• Buffer EB(Elution Buffer)

10mM Tris-HCl, pH8.5(25℃)

菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した

↓cfg.　4℃　6,000rpm　2min

↓デカンテーションで上清を捨てた（＊の操作を菌液全量を使うまで繰り返した）

↓SolutionⅠ100μLを加え、vortexにより撹拌

↓常温　5min　放置

↓SolutionⅡ200μLを加え、上下に転倒させた

↓氷上　5min　放置

↓SolutionⅢ150μLを加え、vortexにより撹拌

↓氷上　5min　放置

↓cfg.　4℃　15,000rpm　5min

↓上清を新しい1.5mLエッペンに移し、ΦOH/CIAA200μLを加えてvortexにより撹拌

↓cfg.　4℃　15,000rpm　5min

↓上部の水層を新しい1.5mLエッペンに移した

↓100%EtOH 1mLを加え、上下に転倒した

↓　常温　10min　放置

↓　cfg.　4℃　15,000rpm　12min

↓上層を取り除いた

↓70%EtOH 500μLを加えた

↓　cfg.　4℃　15,000rpm　3min

↓EtOHを除いた

↓遠心乾燥した　2min

↓滅菌水30μLに溶かした

制限酵素処理

DNAsol・・・・・・・・5μL

制限酵素Ⅰ(　　　)・・・1μL

制限酵素Ⅱ(　　　)・・・1μL

◯Buffer・・・・・・・・・5μL

H2O・・・・・・・・・38μL

Total・・・・・・・・・50μL　　　　で分注した

↓37℃でover night

DNAのゲル抽出(QIAGEN kit使用)

【実験】

制限酵素処理をした（　　　　　　　　　）：Loading dye＝５：１になるように加えた。

↓ゲルにプラスミドDNA、１kbpマーカーを添加した。

↓50V、60minで電気泳動した

↓1％アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。

↓EtBrを取り除いた。

↓暗室、UV照射化でベクターorインサートの部分を切り出した。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

↓切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。→　　　g

↓ゲルの3倍量のBuffer QG　　　mLを加えた。　

↓50℃のwater bathで10min　incubateした。(4分毎にvoltex)

↓溶解後ゲルと等量のisopropanol　　　mLを加え、カラムに移し替えた。

↓cfg.10,000rpm 1min

↓抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。

↓cfg.10,000rpm 1min

↓Buffer PE 0.75ｍLを加えた

↓cfg.10,000rpm 1min

↓抽出物を捨てた。

↓cfg.10,000rpm 1min

↓蓋を切ったエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。

↓cfg.10,000rpm 1min

↓別のエッペンに移し替え、100倍希釈で吸光度OD260を測定した。

ライゲーション

Insert (　　　)・・・ 　　　μl

Vevtor (　　　) ・・　　　μl 10μL

H₂O₂ ・・・・・・・　　　μl

Ligation Mix ・・・・・10μL

Total・・・・・・・・・・20μl

↓16℃　30min　放置(Heat block使用) 

トランスフォーメーション

↓プラスミドDNA　1μLを1.5mLマイクロチューブに移す

↓コンピタントセル100μLを加えた

↓氷上　30min　放置

↓42℃で45secヒートショック

↓氷上　2min　放置

↓37℃に温めたSOC培地を0.9mLずつ加えた

↓37℃で1h振とう培養　

↓LBプレート培地(対応する抗生物質入り)に撒いた

↓37℃インキュベーターでover night (目安16h培養)