Team:KIT-Kyoto/Protocol/Japanese

From 2010.igem.org

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</head></html>
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}
-
 
+
<table border="0" width="965px" align="center"><tr><td>
-
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td width="165px" valign="top" align="left"><div>
+
[[Team:KIT-Kyoto|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Note|Notebook]] > [[Team:KIT-Kyoto/Protocol|Protocol]] > [[Team:KIT-Kyoto/Protocol/Japanese|Japanese]]</td></tr></table>
-
{{Template:KIT-Kyoto/menu10}}
+
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td width="165px" valign="top" align="left"><div>{{Template:KIT-Kyoto/menu10}}
-
</div></td><td width="800px" valign="top" align="left"><div style="padding:3px;">
+
</div></td><td width="800px" valign="top" align="left"><div id="MIGI">
== Protocol ==
== Protocol ==
-
:液体培地の作製方法
+
:[[#液体培地の作製方法|液体培地の作製方法]]
-
::LB液体培地(+amp)
+
::[[#LB液体培地(+amp)|LB液体培地(+amp)]]
-
::LB液体培地(-amp)
+
::[[#LB液体培地(-amp)|LB液体培地(-amp)]]
-
::2XYT培地
+
::[[#2XYT培地|2XYT培地]]
-
::SOB培地  
+
::[[#SOB培地|SOB培地]]
-
::SOC培地  
+
::[[#SOC培地|SOC培地]]
-
:プレート培地の作製方法
+
:[[#プレート培地の作製方法|プレート培地の作製方法]]
-
::LB液体培地(+amp)
+
::[[#LB液体培地(+amp)|LB液体培地(+amp)]]
-
::LB液体培地(-amp)
+
::[[#LB液体培地(-amp)|LB液体培地(-amp)]]
-
:1%アガロースゲルの作り方
+
:[[#1%アガロースゲルの作り方(4~5枚分)|1%アガロースゲルの作り方(4~5枚分)]]
-
:PCR
+
:[[#PCR|PCR]]
-
:アルカリミニプレップ
+
:[[#アルカリミニプレップ|アルカリミニプレップ]]
-
:制限酵素処理
+
:[[#制限酵素処理|制限酵素処理]]
-
:DNAのゲル抽出
+
:[[#DNAのゲル抽出(QIAGEN kit使用)|DNAのゲル抽出(QIAGEN kit使用)]]
-
:ライゲーション
+
:[[#ライゲーション|ライゲーション]]
-
:トランスフォーメーション
+
:[[#トランスフォーメーション|トランスフォーメーション]]
-
<液体培地の作製方法>
+
== 液体培地の作製方法 ==
-
○LB液体培地(+Amp)
+
=== LB液体培地(+amp) ===
-
MilliQ1 LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl    10gを入れるごとに溶かした。
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
          ↓
+
:↓H<sub>2</sub>O 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。
-
121℃20minでオートクレーブ。
+
:↓121℃20minでオートクレーブ。
-
          ↓
+
:↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml加えた。
-
触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml加えた。
+
-
○LB液体培地(-Amp)
+
=== LB液体培地(-amp) ===
-
MilliQ1 LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl    10gを入れるごとに溶かした。
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
          ↓
+
:↓H<sub>2</sub>O 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。
-
121℃20minでオートクレーブ。
+
:↓121℃20minでオートクレーブ。
-
○2×YT培地
+
=== 2×YT培地 ===
-
MilliQ1 LにBacto Tryptone 16g、Bacto Yeast Extract 10g、1M NaCl    5gを入れ、入れるごとに溶かした。
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
          ↓
+
:↓H<sub>2</sub>O 1LにBacto Tryptone 16g、Bacto Yeast Extract 10g、1M NaCl 5gを入れ、入れるごとに溶かした。
-
121℃20minでオートクレーブ。
+
:↓121℃20minでオートクレーブ。
-
○SOB培地
+
=== SOB培地 ===
-
MilliQ1 LにBacto Tryptone 20g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl    5g、250mM KCl 10mg、5N NaOH 0.2mgを入れるごとに溶かした。
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
  ↓
+
:↓H<sub>2</sub>O 1LにBacto Tryptone 20g、Bacto Yeast Extract 5g、
-
121℃20minでオートクレーブ。
+
:↓1M NaCl 5g、250mM KCl 10mg、5N NaOH 0.2mgを入れるごとに溶かした。
-
  ↓
+
:↓121℃20minでオートクレーブ。
-
触れられるぐらいの温度になったら1M MgCl2 10mg、1M MgSO4 10mg
+
:↓触れられるぐらいの温度になったら1M MgCl<sub>2</sub> 10mg、1M MgSO<sub>4</sub> 10mg加えた。
-
加えた。
+
-
○SOC培地
+
=== SOC培地 ===
-
MilliQ1 LにBacto Tryptone 20g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl    5g、5N NaOH 0.2mgを入れるごとに溶かした。
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
  ↓
+
:↓H<sub>2</sub>O 1LにBacto Tryptone 20g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 5g、5N NaOH 0.2mgを入れるごとに溶かした。
-
121℃20minでオートクレーブ。
+
:↓121℃20minでオートクレーブ。
-
  ↓
+
:↓触れられるぐらいの温度になったら1Mグルコース 20mL、1M MgCl<sub>2</sub> 10mg、1M MgSO<sub>4</sub> 10mg加えた。
-
触れられるぐらいの温度になったら1Mグルコース 20mL、1M MgCl2 10mg、1M MgSO4 10mg加えた。
+
-
<プレート培地の作製方法>
+
== プレート培地の作製方法 ==
-
○LBプレート培地(+Amp)
+
=== LBプレート培地(+amp) ===
-
MilliQ 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
          ↓
+
:↓H<sub>2</sub>O 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。
-
121℃20minでオートクレーブ。
+
:↓121℃20minでオートクレーブ。
-
          ↓
+
:↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。
-
触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。
+
-
○LBプレート培地(-Amp)
+
=== LBプレート培地(-amp) ===
-
MilliQ 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
          ↓
+
:↓H<sub>2</sub>O 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。
-
121℃20minでオートクレーブ。
+
:↓121℃20minでオートクレーブ。
-
          ↓
+
:↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。
-
触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。
+
-
<1%アガロースゲルの作り方>(4~5枚分)
+
== 1%アガロースゲルの作り方(4~5枚分) ==
-
三角フラスコに量り取ったアガロース1g、TAE100mLを加えた。
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
  ↓
+
:↓三角フラスコに量り取ったアガロース 1g、TAE100mLを加えた。
-
三角フラスコの口にラップをし、ラップに穴をあけてから浮遊物がなくなるまでレンジで加熱、10secごとに取り出し撹拌
+
:↓三角フラスコの口にラップをし、ラップに穴をあけてから浮遊物がなくなるまでレンジで加熱、10secごとに取り出し撹拌
-
  ↓
+
:↓アガロースゲルが触れる程度に冷えたら型をはめたゲル作成用の鋳型に分注(底の空気を出し、泡を潰した)
-
アガロースゲルが触れる程度に冷えたら型をはめたゲル作成用の鋳型に分注(底の空気を出し、泡を潰した)
+
:↓目的に応じたコームを差し込み、室温で放置し固めた
-
  ↓
+
:↓慎重にコームを抜きとり、作成したゲルを冷蔵庫に保存した
-
目的に応じたコームを差し込み、室温で放置し固めた
+
-
  ↓
+
-
慎重にコームを抜きとり、作成したゲルを冷蔵庫に保存した
+
   
   
-
<PCR>
+
== PCR ==
-
○PCR反応
+
=== PCR反応 ===
-
500μLエッペンに以下の組成で溶液を加えた。
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
Primer Mix・・・・・・・・・・・・・1.5μL
+
:500μLエッペンに以下の組成で溶液を加えた。
-
テンプレートDNA(     )・・・・0.5μL
+
::Primer Mix・・・・・・・・・・・1.5μL
-
10×PCR Buffer for KOD-Plus-・・5μL
+
::テンプレートDNA(      )・・0.5μL
-
2mM d NTPs・・・・・・・・・・・5μL
+
::10×PCR Buffer for KOD-Plus-・・5μL
-
2mM MgSO4 ・・・・・・・・・・・4μL
+
::2mM d NTPs・・・・・・・・・・・5μL
-
MilliQ・・・・・・・・・・・・・・・33μL
+
::2mM MgSO4 ・・・・・・・・・・・4μL
-
KOD-Plus- ・・・・・・・・・・・・1μL
+
::MilliQ・・・・・・・・・・・・・33μL
-
全量・・・・・・・・・・・・・・・50μL
+
::KOD-Plus- ・・・・・・・・・・・1μL
-
         ↓
+
::全量・・・・・・・・・・・・・・50μL
-
以下のプログラムでPCR反応を行った。
+
 
-
熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存
+
:以下のプログラムでPCR反応を行った。
-
94℃ 94℃ (Tm-10)℃ 68℃ 68℃ 4℃
+
::熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存
-
2min 15sec 30sec 1min/1kb 2min ∞
+
::94℃ 94℃ (Tm-10)℃ 68℃ 68℃ 4℃
-
35サイクル
+
::2min 15sec 30sec 1min/1kb 2min ∞
 +
:: 35サイクル
          
          
-
○電気泳動によるPCR産物の確認
+
=== 電気泳動によるPCR産物の確認 ===
-
*各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
  ↓
+
:各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした。
-
1%アガロースゲルに*と1kbpマーカー3μLを添加した
+
:↓1%アガロースゲルに*と1kbpマーカー 3μLを添加した。
-
  ↓
+
:↓100V、15minで電気泳動した。
-
100V、15minで電気泳動
+
  
  
 +
== アルカリミニプレップ ==
 +
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
 +
*試薬組成
 +
:*Buffer P1 (Suspension Buffer)
 +
::50mM Tris-HCl and 10mM EDTA, pH8.0(25℃)50μg/ml
 +
:*Buffer P2 (Lysis Buffer)
 +
::0.2M NaOH and 1%SDS
 +
:*Buffer N3 (Neutralization and Binding Buffer)
 +
::4M guanidine hydrochloride and 0.5M potassium acetate, pH4.2
 +
:*Buffer PB (Wash Buffer)
 +
::5M guanidine hydrochloride,20mM Tris-HCl, pH6.6 (25℃) [final concentrations after addition of ethanol]with 38% ethanol.
 +
:*Buffer PE (Wash Buffer)
 +
::20mM NaCl, 2mM Tris-HCl, pH7.5 (25℃) [final concentrations after addition of ethanol:widh 80% ethanol
 +
:*Buffer EB(Elution Buffer)
 +
::10mM Tris-HCl, pH8.5(25℃)
-
<アルカリミニプレップ>
+
 
-
*菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した
+
:菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した
-
  ↓ cfg. 4℃ 6,000rpm 2min
+
:↓cfg. 4℃ 6,000rpm 2min
-
デカンテーションで上清を捨てた(*の操作を菌液全量を使うまで繰り返した)
+
:↓デカンテーションで上清を捨てた(*の操作を菌液全量を使うまで繰り返した)
-
  ↓
+
:↓SolutionⅠ100μLを加え、vortexにより撹拌
-
SolutionⅠ100μLを加え、vortexにより撹拌
+
:↓常温 5min 放置
-
  ↓ 常温 5min 放置
+
:↓SolutionⅡ200μLを加え、上下に転倒させた
-
SolutionⅡ200μLを加え、上下に転倒させた
+
:↓氷上 5min 放置
-
  ↓ 氷上 5min 放置
+
:↓SolutionⅢ150μLを加え、vortexにより撹拌
-
SolutionⅢ150μLを加え、vortexにより撹拌
+
:↓氷上 5min 放置
-
  ↓ 氷上 5min 放置
+
:↓cfg. 4℃ 15,000rpm 5min
-
  ↓ cfg. 4℃ 15,000rpm 5min
+
:↓上清を新しい1.5mLエッペンに移し、ΦOH/CIAA200μLを加えてvortexにより撹拌
-
上清を新しい1.5mLエッペンに移し、ΦOH/CIAA200μLを加えてvortexにより撹拌
+
:↓cfg. 4℃ 15,000rpm 5min
-
  ↓ cfg. 4℃ 15,000rpm 5min
+
:↓上部の水層を新しい1.5mLエッペンに移した
-
上部の水層を新しい1.5mLエッペンに移した
+
:↓100%EtOH 1mLを加え、上下に転倒した
-
  ↓
+
:↓ 常温 10min 放置
-
100%EtOH 1mLを加え、上下に転倒した
+
:↓ cfg. 4℃ 15,000rpm 12min
-
  ↓ 常温 10min 放置
+
:↓上層を取り除いた
-
  ↓ cfg. 4℃ 15,000rpm 12min
+
:↓70%EtOH 500μLを加えた
-
上層を取り除いた
+
:↓ cfg. 4℃ 15,000rpm 3min
-
  ↓
+
:↓EtOHを除いた
-
70%EtOH 500μLを加えた
+
:↓遠心乾燥した 2min
-
  ↓ cfg. 4℃ 15,000rpm 3min
+
:↓滅菌水30μLに溶かした
-
EtOHを除いた
+
-
  ↓
+
-
遠心乾燥した 2min
+
-
  ↓
+
-
滅菌水30μLに溶かした
+
-
<制限酵素処理>
+
== 制限酵素処理 ==
-
DNAsol・・・・・・・・5μL
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
制限酵素Ⅰ(   )・・・1μL
+
::DNAsol・・・・・・・・5μL
-
制限酵素Ⅱ(   )・・・1μL
+
::制限酵素Ⅰ(   )・・・1μL
-
1×M・・・・・・・・・5μL
+
::制限酵素Ⅱ(   )・・・1μL
-
H2O・・・・・・・・・38μL
+
::◯Buffer・・・・・・・・・5μL
-
Total・・・・・・・・・50μL    で分注した
+
::H2O・・・・・・・・・38μL
-
  ↓
+
::Total・・・・・・・・・50μL    で分注した
-
37℃でover night
+
  
 +
:↓37℃でover night
-
<DNAのゲル抽出>(QIAGEN kit使用)
+
== DNAのゲル抽出(QIAGEN kit使用) ==
 +
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
【実験】
【実験】
-
制限酵素処理をした(         ):Loading dye=5:1になるように加えた
+
:制限酵素処理をした(         ):Loading dye=5:1になるように加えた。
-
  ↓
+
:↓ゲルにプラスミドDNA、1kbpマーカーを添加した。
-
ゲルにプラスミドDNA、1kbpマーカーを添加した
+
:↓50V、60minで電気泳動した
-
  ↓
+
:↓1%アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。
-
50V、60minで電気泳動した
+
:↓EtBrを取り除いた。
-
  ↓
+
:↓暗室、UV照射化でベクターorインサートの部分を切り出した。                    
-
1%アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。
+
:↓切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。→   g
-
↓ 
+
:↓ゲルの3倍量のBuffer QG   mLを加えた。 
-
EtBrを取り除いた。
+
:↓50℃のwater bathで10min incubateした。(4分毎にvoltex)
-
  ↓
+
:↓溶解後ゲルと等量のisopropanol   mLを加え、カラムに移し替えた。
-
暗室、UV照射化でベクターorインサートの部分を切り出した。                    
+
:↓cfg.10,000rpm 1min
-
  ↓
+
:↓抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。
-
切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。   g
+
:↓cfg.10,000rpm  1min
-
  ↓
+
:↓Buffer PE 0.75mLを加えた
-
ゲルの3倍量のBuffer QG   mLを加えた。
+
:↓cfg.10,000rpm  1min
-
↓ 
+
:↓抽出物を捨てた。
-
50℃のwater bathで10min incubateした。(4分毎にvoltex)
+
:↓cfg.10,000rpm  1min
-
  ↓
+
:↓蓋を切ったエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。
-
溶解後ゲルと等量のisopropanol   mLを加え、カラムに移し替え
+
:↓cfg.10,000rpm  1min
-
た。
+
:↓別のエッペンに移し替え、100倍希釈で吸光度OD260を測定した。
-
  ↓cfg.10,000rpm 1min
+
-
抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。
+
-
  ↓cfg.10,000rpm  1min
+
-
Buffer PE 0.75mLを加えた
+
-
  ↓cfg.10,000rpm  1min
+
-
抽出物を捨てた。
+
-
  ↓cfg.10,000rpm  1min
+
-
蓋を切ったエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。
+
-
  ↓cfg.10,000rpm  1min
+
-
別のエッペンに移し替え、100倍希釈で吸光度OD260を測定した。
+
-
<ライゲーション>
+
== ライゲーション ==
-
Insert (   )・・・    μl  
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
Vevtor (   ) ・・   μl    10μL
+
::Insert (   )・・・    μl  
-
MilliQ ・・・・・・・   μl
+
::Vevtor (   ) ・・   μl    10μL
-
Ligation Mix  ・・・・・10μL  
+
::H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> ・・・・・・・   μl
-
Total・・・・・・・・・・20μl
+
::Ligation Mix  ・・・・・10μL  
-
  ↓
+
::Total・・・・・・・・・・20μl
-
16℃ 30min 放置(Heat block使用) 
+
 
-
<トランスフォーメーション>
+
:↓16℃ 30min 放置(Heat block使用) 
-
プラスミドDNA 1μLを1.5mLマイクロチューブに移す
+
 
-
  ↓
+
== トランスフォーメーション ==
-
コンピタントセル100μLを加えた
+
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#Protocol|>>top]]</span></div>
-
  ↓ 氷上 30min 放置
+
:↓プラスミドDNA 1μLを1.5mLマイクロチューブに移す
-
42℃で45secヒートショック
+
:↓コンピタントセル100μLを加えた
-
  ↓ 氷上 2min 放置
+
:↓氷上 30min 放置
-
37℃に温めたSOC培地を0.9mLずつ加えた
+
:↓42℃で45secヒートショック
-
  ↓ 37℃で1h振とう培養 
+
:↓氷上 2min 放置
-
LBプレート培地(対応する抗生物質入り)に撒いた
+
:↓37℃に温めたSOC培地を0.9mLずつ加えた
-
  ↓
+
:↓37℃で1h振とう培養 
-
37℃インキュベーターでover night (目安16h培養)
+
:↓LBプレート培地(対応する抗生物質入り)に撒いた
 +
:↓37℃インキュベーターでover night (目安16h培養)

Latest revision as of 08:58, 9 October 2010



Home > Notebook > Protocol > Japanese

Protocol

液体培地の作製方法
LB液体培地(+amp)
LB液体培地(-amp)
2XYT培地
SOB培地
SOC培地
プレート培地の作製方法
LB液体培地(+amp)
LB液体培地(-amp)
1%アガロースゲルの作り方(4~5枚分)
PCR
アルカリミニプレップ
制限酵素処理
DNAのゲル抽出(QIAGEN kit使用)
ライゲーション
トランスフォーメーション


液体培地の作製方法

LB液体培地(+amp)

↓H2O 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。
↓121℃20minでオートクレーブ。
↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml加えた。

LB液体培地(-amp)

↓H2O 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。
↓121℃20minでオートクレーブ。

2×YT培地

↓H2O 1LにBacto Tryptone 16g、Bacto Yeast Extract 10g、1M NaCl 5gを入れ、入れるごとに溶かした。
↓121℃20minでオートクレーブ。


SOB培地

↓H2O 1LにBacto Tryptone 20g、Bacto Yeast Extract 5g、
↓1M NaCl 5g、250mM KCl 10mg、5N NaOH 0.2mgを入れるごとに溶かした。
↓121℃20minでオートクレーブ。
↓触れられるぐらいの温度になったら1M MgCl2 10mg、1M MgSO4 10mg加えた。

SOC培地

↓H2O 1LにBacto Tryptone 20g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 5g、5N NaOH 0.2mgを入れるごとに溶かした。
↓121℃20minでオートクレーブ。
↓触れられるぐらいの温度になったら1Mグルコース 20mL、1M MgCl2 10mg、1M MgSO4 10mg加えた。

プレート培地の作製方法

LBプレート培地(+amp)

↓H2O 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。
↓121℃20minでオートクレーブ。
↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。


LBプレート培地(-amp)

↓H2O 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。
↓121℃20minでオートクレーブ。
↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。

1%アガロースゲルの作り方(4~5枚分)

↓三角フラスコに量り取ったアガロース 1g、TAE100mLを加えた。
↓三角フラスコの口にラップをし、ラップに穴をあけてから浮遊物がなくなるまでレンジで加熱、10secごとに取り出し撹拌
↓アガロースゲルが触れる程度に冷えたら型をはめたゲル作成用の鋳型に分注(底の空気を出し、泡を潰した)
↓目的に応じたコームを差し込み、室温で放置し固めた
↓慎重にコームを抜きとり、作成したゲルを冷蔵庫に保存した

PCR

PCR反応

500μLエッペンに以下の組成で溶液を加えた。
Primer Mix・・・・・・・・・・・1.5μL
テンプレートDNA(      )・・0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-・・5μL
2mM d NTPs・・・・・・・・・・・5μL
2mM MgSO4 ・・・・・・・・・・・4μL
MilliQ・・・・・・・・・・・・・33μL
KOD-Plus- ・・・・・・・・・・・1μL
全量・・・・・・・・・・・・・・50μL
以下のプログラムでPCR反応を行った。
熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存
94℃ 94℃ (Tm-10)℃ 68℃ 68℃ 4℃
2min 15sec 30sec 1min/1kb 2min ∞
35サイクル

          

電気泳動によるPCR産物の確認

各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした。
↓1%アガロースゲルに*と1kbpマーカー 3μLを添加した。
↓100V、15minで電気泳動した。

  

アルカリミニプレップ

  • 試薬組成
  • Buffer P1 (Suspension Buffer)
50mM Tris-HCl and 10mM EDTA, pH8.0(25℃)50μg/ml
  • Buffer P2 (Lysis Buffer)
0.2M NaOH and 1%SDS
  • Buffer N3 (Neutralization and Binding Buffer)
4M guanidine hydrochloride and 0.5M potassium acetate, pH4.2
  • Buffer PB (Wash Buffer)
5M guanidine hydrochloride,20mM Tris-HCl, pH6.6 (25℃) [final concentrations after addition of ethanol]with 38% ethanol.
  • Buffer PE (Wash Buffer)
20mM NaCl, 2mM Tris-HCl, pH7.5 (25℃) [final concentrations after addition of ethanol:widh 80% ethanol
  • Buffer EB(Elution Buffer)
10mM Tris-HCl, pH8.5(25℃)


菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した
↓cfg. 4℃ 6,000rpm 2min
↓デカンテーションで上清を捨てた(*の操作を菌液全量を使うまで繰り返した)
↓SolutionⅠ100μLを加え、vortexにより撹拌
↓常温 5min 放置
↓SolutionⅡ200μLを加え、上下に転倒させた
↓氷上 5min 放置
↓SolutionⅢ150μLを加え、vortexにより撹拌
↓氷上 5min 放置
↓cfg. 4℃ 15,000rpm 5min
↓上清を新しい1.5mLエッペンに移し、ΦOH/CIAA200μLを加えてvortexにより撹拌
↓cfg. 4℃ 15,000rpm 5min
↓上部の水層を新しい1.5mLエッペンに移した
↓100%EtOH 1mLを加え、上下に転倒した
↓ 常温 10min 放置
↓ cfg. 4℃ 15,000rpm 12min
↓上層を取り除いた
↓70%EtOH 500μLを加えた
↓ cfg. 4℃ 15,000rpm 3min
↓EtOHを除いた
↓遠心乾燥した 2min
↓滅菌水30μLに溶かした

制限酵素処理

DNAsol・・・・・・・・5μL
制限酵素Ⅰ(   )・・・1μL
制限酵素Ⅱ(   )・・・1μL
◯Buffer・・・・・・・・・5μL
H2O・・・・・・・・・38μL
Total・・・・・・・・・50μL    で分注した

  

↓37℃でover night

DNAのゲル抽出(QIAGEN kit使用)

【実験】

制限酵素処理をした(         ):Loading dye=5:1になるように加えた。
↓ゲルにプラスミドDNA、1kbpマーカーを添加した。
↓50V、60minで電気泳動した
↓1%アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。
↓EtBrを取り除いた。
↓暗室、UV照射化でベクターorインサートの部分を切り出した。                    
↓切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。→   g
↓ゲルの3倍量のBuffer QG   mLを加えた。 
↓50℃のwater bathで10min incubateした。(4分毎にvoltex)
↓溶解後ゲルと等量のisopropanol   mLを加え、カラムに移し替えた。
↓cfg.10,000rpm 1min
↓抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。
↓cfg.10,000rpm 1min
↓Buffer PE 0.75mLを加えた
↓cfg.10,000rpm 1min
↓抽出物を捨てた。
↓cfg.10,000rpm 1min
↓蓋を切ったエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。
↓cfg.10,000rpm 1min
↓別のエッペンに移し替え、100倍希釈で吸光度OD260を測定した。

ライゲーション

Insert (   )・・・    μl
Vevtor (   ) ・・   μl 10μL
H2O2 ・・・・・・・   μl
Ligation Mix ・・・・・10μL
Total・・・・・・・・・・20μl
↓16℃ 30min 放置(Heat block使用) 

トランスフォーメーション

↓プラスミドDNA 1μLを1.5mLマイクロチューブに移す
↓コンピタントセル100μLを加えた
↓氷上 30min 放置
↓42℃で45secヒートショック
↓氷上 2min 放置
↓37℃に温めたSOC培地を0.9mLずつ加えた
↓37℃で1h振とう培養 
↓LBプレート培地(対応する抗生物質入り)に撒いた
↓37℃インキュベーターでover night (目安16h培養)