Team:KIT-Kyoto/Protocol/Japanese
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== 液体培地の作製方法 == | == 液体培地の作製方法 == | ||
=== LB液体培地(+amp) === | === LB液体培地(+amp) === | ||
- | : | + | :↓H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。 |
:↓121℃20minでオートクレーブ。 | :↓121℃20minでオートクレーブ。 | ||
:↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml加えた。 | :↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml加えた。 | ||
=== LB液体培地(-amp) === | === LB液体培地(-amp) === | ||
- | : | + | :↓H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。 |
- | : | + | :↓121℃20minでオートクレーブ。 |
=== 2×YT培地 === | === 2×YT培地 === | ||
- | : | + | :↓H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 1LにBacto Tryptone 16g、Bacto Yeast Extract 10g、1M NaCl 5gを入れ、入れるごとに溶かした。 |
:↓121℃20minでオートクレーブ。 | :↓121℃20minでオートクレーブ。 | ||
=== SOB培地 === | === SOB培地 === | ||
- | : | + | :↓H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 1LにBacto Tryptone 20g、Bacto Yeast Extract 5g、 |
- | :↓1M | + | :↓1M NaCl 5g、250mM KCl 10mg、5N NaOH 0.2mgを入れるごとに溶かした。 |
- | : | + | :↓121℃20minでオートクレーブ。 |
- | :↓触れられるぐらいの温度になったら1M | + | :↓触れられるぐらいの温度になったら1M MgCl<sub>2</sub> 10mg、1M MgSO<sub>4</sub> 10mg加えた。 |
=== SOC培地 === | === SOC培地 === | ||
- | : | + | :↓H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 1LにBacto Tryptone 20g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 5g、5N NaOH 0.2mgを入れるごとに溶かした。 |
- | : | + | :↓121℃20minでオートクレーブ。 |
- | :↓触れられるぐらいの温度になったら1Mグルコース 20mL、1M | + | :↓触れられるぐらいの温度になったら1Mグルコース 20mL、1M MgCl<sub>2</sub> 10mg、1M MgSO<sub>4</sub> 10mg加えた。 |
== プレート培地の作製方法 == | == プレート培地の作製方法 == | ||
=== LBプレート培地(+amp) === | === LBプレート培地(+amp) === | ||
- | : | + | :↓H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。 |
:↓121℃20minでオートクレーブ。 | :↓121℃20minでオートクレーブ。 | ||
:↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。 | :↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。 | ||
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=== LBプレート培地(-amp) === | === LBプレート培地(-amp) === | ||
- | : | + | :↓H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 1LにBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、1M NaCl 10gを入れるごとに溶かした。 |
:↓121℃20minでオートクレーブ。 | :↓121℃20minでオートクレーブ。 | ||
:↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。 | :↓触れられるぐらいの温度になったらAmpicillin 1ml、アガロース20gを加えシャーレに移した。 | ||
- | == | + | == 1%アガロースゲルの作り方(4~5枚分) == |
- | : | + | :↓三角フラスコに量り取ったアガロース 1g、TAE100mLを加えた。 |
:↓三角フラスコの口にラップをし、ラップに穴をあけてから浮遊物がなくなるまでレンジで加熱、10secごとに取り出し撹拌 | :↓三角フラスコの口にラップをし、ラップに穴をあけてから浮遊物がなくなるまでレンジで加熱、10secごとに取り出し撹拌 | ||
:↓アガロースゲルが触れる程度に冷えたら型をはめたゲル作成用の鋳型に分注(底の空気を出し、泡を潰した) | :↓アガロースゲルが触れる程度に冷えたら型をはめたゲル作成用の鋳型に分注(底の空気を出し、泡を潰した) | ||
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=== PCR反応 === | === PCR反応 === | ||
:500μLエッペンに以下の組成で溶液を加えた。 | :500μLエッペンに以下の組成で溶液を加えた。 | ||
- | ::Primer | + | ::Primer Mix・・・・・・・・・・・1.5μL |
- | ::テンプレートDNA( ) | + | ::テンプレートDNA( )・・0.5μL |
::10×PCR Buffer for KOD-Plus-・・5μL | ::10×PCR Buffer for KOD-Plus-・・5μL | ||
::2mM d NTPs・・・・・・・・・・・5μL | ::2mM d NTPs・・・・・・・・・・・5μL | ||
::2mM MgSO4 ・・・・・・・・・・・4μL | ::2mM MgSO4 ・・・・・・・・・・・4μL | ||
- | :: | + | ::MilliQ・・・・・・・・・・・・・33μL |
- | ::KOD-Plus- | + | ::KOD-Plus- ・・・・・・・・・・・1μL |
- | :: | + | ::全量・・・・・・・・・・・・・・50μL |
:以下のプログラムでPCR反応を行った。 | :以下のプログラムでPCR反応を行った。 | ||
::熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 | ::熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 | ||
- | ::94℃ 94℃ (Tm-10)℃ 68℃ 68℃ | + | ::94℃ 94℃ (Tm-10)℃ 68℃ 68℃ 4℃ |
::2min 15sec 30sec 1min/1kb 2min ∞ | ::2min 15sec 30sec 1min/1kb 2min ∞ | ||
- | :: | + | :: 35サイクル |
=== 電気泳動によるPCR産物の確認 === | === 電気泳動によるPCR産物の確認 === | ||
- | ::各PCR反応後の溶液各5μLにLoading | + | ::各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした。 |
- | :↓1% | + | :↓1%アガロースゲルに*と1kbpマーカー 3μLを添加した。 |
- | : | + | :↓100V、15minで電気泳動した。 |
== アルカリミニプレップ == | == アルカリミニプレップ == | ||
- | + | :菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した | |
:↓cfg. 4℃ 6,000rpm 2min | :↓cfg. 4℃ 6,000rpm 2min | ||
:↓デカンテーションで上清を捨てた(*の操作を菌液全量を使うまで繰り返した) | :↓デカンテーションで上清を捨てた(*の操作を菌液全量を使うまで繰り返した) | ||
Line 150: | Line 150: | ||
== DNAのゲル抽出(QIAGEN kit使用) == | == DNAのゲル抽出(QIAGEN kit使用) == | ||
【実験】 | 【実験】 | ||
- | + | :制限酵素処理をした( ):Loading dye=5:1になるように加えた。 | |
:↓ゲルにプラスミドDNA、1kbpマーカーを添加した。 | :↓ゲルにプラスミドDNA、1kbpマーカーを添加した。 | ||
:↓50V、60minで電気泳動した | :↓50V、60minで電気泳動した |
Revision as of 05:36, 28 September 2010
Protocol
液体培地の作製方法LB液体培地(+amp)
LB液体培地(-amp)
2×YT培地
SOB培地
SOC培地
プレート培地の作製方法LBプレート培地(+amp)
LBプレート培地(-amp)
1%アガロースゲルの作り方(4~5枚分)
PCRPCR反応
電気泳動によるPCR産物の確認
アルカリミニプレップ
制限酵素処理
DNAのゲル抽出(QIAGEN kit使用)【実験】
ライゲーション
トランスフォーメーション
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