Team:KIT-Kyoto/Notebook-week10

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October 10

No experiments.

October 11

Time

9:00~

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

  1. DNA digestion of pSB6A1(ahpC,GFP) by restriction enzymes and isolation of DNA fragments from agarose gel and ligation and transformation. [Fukuyama]
(1) pSB6A1(ahpC,GFP)の制限酵素処理、ゲルを使ったDNA抽出、ライゲーション、トランスフォーメーション [福山]
   ベクター :pSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)
   インサート:ahpC+GFP(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)

Method

(1) 表1のとおりに調製し、37℃で1時間インキュベートした
 ↓2つあった表1の試料を合わせて、全量を200 μlにした
 ↓MilliQを450 μl,酢酸ナトリウムを50 μl加え、
  さらにフェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた
 ↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
 ↓上清を回収し、そこにイソプロパノールを800 μl加えた
 ↓20分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
 ↓上清を捨て、70%エタノールを500 μl加えた
 ↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
 ↓上清を捨て、乾燥させた
 ↓沈殿をMilliQ 20 μlにとかし、Orange -loading dyeを5 μl加え、電気泳動を行った
 ↓バンドを切り出して、MilliQを400 μl加えた
 ↓フェノールを等量加え、ボルテックス
 ↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
 ↓上清を回収した
 ↓フェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス
 ↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
 ↓上清を回収し、ベクターであるpSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)
  の入ったエッペンドルフチューブに入れた(ベクターの正確な量はわからない)
 ↓イソプロパノールをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた
 ↓20分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
 ↓上清を捨てた
 ↓70%エタノールを500 μl加えた
 ↓5分間遠心した(4℃、14,500 rpm)
 ↓上清を捨てた
 ↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた
 ↓16℃に30分間置いた
 ↓DH5α懸濁液を100 μl加えた
 ↓氷上に30分間置いた
 ↓42℃に30分間置いた
 ↓氷上に2分間置いた
 ↓soc培地を900 μl加えた
 ↓37℃で1時間振とう培養した
 ↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した
 ↓37℃で一晩インキュベートした
表1: 制限酵素処理
単位はμl
DNA溶液88
EcoRⅠ1
Pst1
Buffer H10
全量100

Results

 特に結果として記すものはなかった

October 12

Time

Member

竹内
Takeuchi

Purpose

  1. Picking up single colony of pSB1C3(ahpC,GFP).[Takeuchi]
(1) pSB1C3(ahpC,GFP)のシングルコロニーのピックアップ

Results

(1) pSB1C3(ahpC,GFP)のシングルコロニーのピックアップ
 前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが2つ見られたのでピックアップし、

それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、 午前中から夕方までは37℃で振とう培養し、夕方からはovernightで室温で振とう培養した

Results

(1) 特に結果として示せるものはなかった

October 13

Time

12:00~

Member

福山
Fukuyama

Purpose

  1. DNA miniprep of pSB1C3(ahpC,GFP) and concentration.[Fukuyama]
  2. Concentrate of pSB1C3(ahpC)[Fukuyama]
(1) pSB1C3(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップと濃縮
(2) pSB1C3(ahpC)の濃縮

【実験方法】

(1) pSB1C3(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップと濃縮
 LB液体培地で培養したpSB1C3(ahpC,GFP)を遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
 ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
 ↓上清を新しいチューブに移した
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
 ↓カラムにMilliQを100 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
 ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
 ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
 ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
 ↓上清を捨て、乾燥させた
 ↓TE20 μl加えた
 ↓このうち10 μlとり、別のエッペンドルチューブにいれた
(2) pSB1C3(ahpC)の濃縮
 ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
 ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*2)
 ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
 ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
 ↓上清を捨て、乾燥させた
 ↓TE20 μl加えた
 ↓このうち10 μlとり、別のエッペンドルチューブにいれた

Results

(1) 濃度は測らなかったが、(*1)を終えたところで、DNAと思われる沈殿が観察された
(2) 濃度は測らなかったが、(*2)を終えたところで、DNAと思われる沈殿が観察された