Template:KIT-Kyoto-Augsut26

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August 26

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Time

9:00～

Member

岩城,竹内,中村,臼井,足立

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Adachi

Purpose

(1)　大腸菌の生存曲線を調べ(2日目)、生存曲線を作成　[足立]

(2)　前日にアルカリミニプレップした

pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)を制限酵素で処理、処理の確認(電気泳動)　[臼井]

(3)　SodAのプロモーターをPCRによって増幅　[臼井]

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

　前日まいたコロニーの数を数え、今までのデータを統計、生存曲線を作成した

(2)　pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)の制限酵素処理

　右表の組成で制限酵素処理を行い、37℃で1時間インキュベートした
　↓電気泳動を以下の方法で行った
　　　　1×ladderをマーカーとし、一番左のコームに流した
　　　　↓Loading Buffer1μLに対し
　　　　　pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)をぞれぞれ5μLの割合で加え左から
　　　　　2∼4番目にpSB1A2(E0430)、
　　　　　5~7番目にpSB1A2(J22005)、
　　　　　8番目(右端)にpSB1A2(I13507)をそれぞれコームに流した

　↓結果を写真撮影した

＜組成＞
EcoRⅠ	lμL
PstⅠ	1μL
プラスミドDNA	5μL
10×H Buffer	2μL
H₂O	11μL
全量	20μL

(3)　SodAのPCR処理

下表の組成でテンプレートDNAにDH5αを使用したものを2本(DH5α-1,DH5α-2)、
JM109を使用したものを2本(JM109-1,JM109-2)作製した
↓以下のプログラムでPCR処理を行った

＜PCR試薬の組成＞
	SodA
PrimerF	1.5μL
PrimerR	1.5μL
dNTPs	5μL
KOD-Plus- Buffer	5μL
テンプレートDNA (DH5α,JM109)	0.5μL
MgSO₄	4μL
H₂O	31.5μL
KOD-Plus-	1μL
total	50μL

Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
94℃	94℃	62.2℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	保持
	30サイクル

Results

(1)　計測した結果を以下にまとめた

[H₂O₂]	0mM	1nM	10nM	100nM	1μM	10μM	100μM	1mM	10mM	100mM
コロニー数	231	220	165	133	109	80	31	1	0	0

これを元に、大腸菌の生存曲線を作成した

以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断した

図17Bは、大腸菌XL-ブルーおよびO-112a,c血清型の生存能力に対するH₂O₂の濃度依存的毒性を示す

<引用文献>
　桂川国際特許事務所
[http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html 「抗体または好中球を介するオゾン生成」]

(2)　pSB1A2(E0430)はすべてバンドが見えたので、

バンドの一番濃かった左から4番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)

pSB1A2(J22005)は左から6番目と7番目がバンドが見えたので、

7番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)

RFP(I13507)はバンドが現れなかった

(3)　PCR処理を行った4つ全てについてSodAが十分量含まれていることが27日(金)の電気泳動によりわかった