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From 2010.igem.org

August 26

Time

9:00～

Member

岩城,竹内,中村,臼井,足立

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Adachi

Purpose

1. The survivorship curve of E. coli　is examined.[Adachi]
2. pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005) and pSB1A2(I13507) digestion by restriction enzymes.And confirm by Agarose gel electrophoresis.[Usui]
3. PCR of SodA.[Usui]

(1)　大腸菌の生存曲線を調べ(2日目)、生存曲線を作成　[足立]

(2)　前日にアルカリミニプレップした

pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)を制限酵素で処理、処理の確認(電気泳動)　[臼井]

(3)　SodAのプロモーターをPCRによって増幅　[臼井]

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

　前日まいたコロニーの数を数え、今までのデータを統計、生存曲線を作成した

(2)　pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)の制限酵素処理

右表の組成で制限酵素処理を行い、37℃で1時間インキュベートした 　↓電気泳動を以下の方法で行った 　　　　1×ladderをマーカーとし、一番左のコームに流した 　　　　↓Loading Buffer1μLに対し 　　　　　pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)をぞれぞれ5μLの割合で加え左から 　　　　　2∼4番目にpSB1A2(E0430)、 　　　　　5~7番目にpSB1A2(J22005)、 　　　　　8番目(右端)にpSB1A2(I13507)をそれぞれコームに流した 　↓結果を写真撮影した

＜組成＞ EcoRⅠ lμL PstⅠ 1μL プラスミドDNA 5μL 10×H Buffer 2μL H2O 11μL 全量 20μL

(3)　SodAのPCR処理

下表の組成でテンプレートDNAにDH5αを使用したものを2本(DH5α-1,DH5α-2)、 JM109を使用したものを2本(JM109-1,JM109-2)作製した ↓以下のプログラムでPCR処理を行った	＜PCR試薬の組成＞ SodA PrimerF 1.5μL PrimerR 1.5μL dNTPs 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL テンプレートDNA (DH5α,JM109) 0.5μL MgSO4 4μL H2O 31.5μL KOD-Plus- 1μL total 50μL
Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 94℃ 94℃ 62.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル

Results

(1)　計測した結果を以下にまとめた

[H2O2]	0mM	1nM	10nM	100nM	1μM	10μM	100μM	1mM	10mM	100mM
コロニー数	231	220	165	133	109	80	31	1	0	0

これを元に、大腸菌の生存曲線を作成した

以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断した

図17Bは、大腸菌XL-ブルーおよびO-112a,c血清型の生存能力に対するH2O2の濃度依存的毒性を示す <引用文献> 　桂川国際特許事務所 「抗体または好中球を介するオゾン生成」

(2)　pSB1A2(E0430)はすべてバンドが見えたので、

バンドの一番濃かった左から4番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)

pSB1A2(J22005)は左から6番目と7番目がバンドが見えたので、

7番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)

RFP(I13507)はバンドが現れなかった

(3)　PCR処理を行った4つ全てについてSodAが十分量含まれていることが27日(金)の電気泳動によりわかった