Template:KIT-Kyoto-Augsut26

From 2010.igem.org

August 26

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Time

9:00~

Member

岩城,竹内,中村,臼井,足立
Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Adachi

Purpose

  1. The survivorship curve of E. coli is examined.[Adachi]
  2. pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005) and pSB1A2(I13507) digestion by restriction enzymes.And confirm by Agarose gel electrophoresis.[Usui]
  3. PCR of SodA.[Usui]
(1) 大腸菌の生存曲線を調べ(2日目)、生存曲線を作成 [足立]
(2) 前日にアルカリミニプレップした
pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)を制限酵素で処理、処理の確認(電気泳動) [臼井]
(3) SodAのプロモーターをPCRによって増幅 [臼井]

Method

(1) 大腸菌の生存曲線を調べる
 前日まいたコロニーの数を数え、今までのデータを統計、生存曲線を作成した
(2) pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)の制限酵素処理

 右表の組成で制限酵素処理を行い、37℃で1時間インキュベートした
 ↓電気泳動を以下の方法で行った
    1×ladderをマーカーとし、一番左のコームに流した
    ↓Loading Buffer1μLに対し
     pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)をぞれぞれ5μLの割合で加え左から
     2∼4番目にpSB1A2(E0430)、
     5~7番目にpSB1A2(J22005)、
     8番目(右端)にpSB1A2(I13507)をそれぞれコームに流した

 ↓結果を写真撮影した
<組成>
EcoRlμL
Pst1μL
プラスミドDNA5μL
10×H Buffer2μL
H2O11μL
全量20μL
(3) SodAのPCR処理
下表の組成でテンプレートDNAにDH5αを使用したものを2本(DH5α-1,DH5α-2)、
JM109を使用したものを2本(JM109-1,JM109-2)作製した
↓以下のプログラムでPCR処理を行った
<PCR試薬の組成>
SodA
PrimerF1.5μL
PrimerR1.5μL
dNTPs5μL
KOD-Plus- Buffer5μL
テンプレートDNA
(DH5α,JM109)
0.5μL
MgSO44μL
H2O31.5μL
KOD-Plus-1μL
total50μL
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃62.2℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec1min2min保持
30サイクル
Results
(1) 計測した結果を以下にまとめた
[H2O2]0mM1nM10nM100nM1μM10μM100μM1mM10mM100mM
コロニー数2312201651331098031100

これを元に、大腸菌の生存曲線を作成した
0826-生存曲線.jpg

以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断した
0826-引用画像.jpg 図17Bは、大腸菌XL-ブルーおよびO-112a,c血清型の生存能力に対するH2O2の濃度依存的毒性を示す


<引用文献>
 桂川国際特許事務所
[http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html 「抗体または好中球を介するオゾン生成」]
(2) pSB1A2(E0430)はすべてバンドが見えたので、
バンドの一番濃かった左から4番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)
pSB1A2(J22005)は左から6番目と7番目がバンドが見えたので、
7番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)
RFP(I13507)はバンドが現れなかった
(3) PCR処理を行った4つ全てについてSodAが十分量含まれていることが27日(金)の電気泳動によりわかった