Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August11

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===ligation反応系===
===ligation反応系===
PCR productsは前日に作成した３番（1-23L（terminator）178 bp）を１つだけ使用した
PCR productsは前日に作成した３番（1-23L（terminator）178 bp）を１つだけ使用した
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|style="border-right:1px solid #000;"| 制限酵素処理
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| colspan="4" style="background-color:#ffd;"| @60℃ 15 min
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|style="border-right:1px solid #000;"| ligation solution
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|style="border-right:1px solid #000;"| Ligation反応
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Revision as of 04:31, 19 September 2010

Notebook

LB培養

  • 2 mLのLBに抗生物質を2 uLずつ加えた
  • 白金耳でコロニーをとり，LBに移した
  • １本以外は生育が悪かったため，再び作り直した
  • 同時に，翌日のmini prepのために2 mLずつ作った

グリセロールストック作成

  • 80% Glycerol 1 mLをスクリューキャップのチューブにとった
  • やや濁った（約2時間培養）LB液体培地を1 mLとり，加えた
  • -80℃に保存した

Ligation

ligation用DNAの調製

  • 前日にPCRした50 uLのうち電気泳動しなかった49 uLを使用した
  • 制限酵素処理するまえにプライマーを除去するため，ろ過を行った
    • 分子量10000 Da以下を通すフィルタ（緑チューブ）を使用
    • 500 uLにするため450 uLのTEを加えた
    • ４サンプルすべてが45 uL以下になるまで１時間以上，10000Gで遠心した
  • 遠心したサンプルの容量を量り，（元の）45 uLになるようにTEでメスアップした
    • 後でLigation反応をするウォーターバスが500 uLチューブ用なので，これを使用した

ligation反応系

PCR productsは前日に作成した３番（1-23L（terminator）178 bp）を１つだけ使用した

１ ２ ３ ４
PCR products 1 uL 1 uL 1 uL 1 uL
10x H Buffer - 1 uL 1 uL 1 uL
DW 9 uL 7.5 uL 7.0 uL 7.5 uL
Xba1 - 0.5 uL 0.5 uL -
Pst1 - - 0.5 uL 0.5 uL
制限酵素処理 4℃ @37℃ 60 min
制限酵素不活化 @60℃ 15 min
ligation solution 10 uL 10 uL 10 uL 10 uL
Ligation反応 @16℃ 30 min
6x SB 4 uL 4 uL 4 uL 4 uL
1% Agarose Gel Electrophoresis in 1/2 TBE

電気泳動

  • 制限酵素処理したサンプル１～４を電気泳動した
  • マーカーはpUC119/Hinf
  • DNA solutionが薄すぎたため，バンドが見えなかった
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