Template:KIT-Kyoto-Augsut19

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Augsut 19

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9:00~

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岩城、古道、竹内、中村
Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Title

(1) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション [中村]
(2) pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク [中村]
(3) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ(18日の続き) [中村]
(4) プロモーター(PoxyR、acrAB)のPCRと電気泳動 [竹内]
(5) コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き) [古道]

Purpose

  1. Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells.[Nakamura]
  2. Picking up single colony of pSB1A2(I732019,I732950) and pSB4A5(K193602).[Nakamura]
  3. DNA midiprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0420).[Nakamura]
  4. Increasing promoter by PCR and checking by agarose gel electrophoresis.[Takeuchi]
  5. Preparing chemically competent cells.[Furumichi]
(1) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション
(2) pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のシングルコロニーを得る
(3) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ
(4) プロモーター(PoxyR、acrAB)を増やし、それを確認する
(5) 18日の続きのコンピタントセル(DH5α)の調整を行う

Method

(1) pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション
 -80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解
 ↓DH5α100μLに対し、l13522[2-(8A)]及び、R0040(1-6I)各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合
 ↓on ice 30min
 ↓45℃で45sec、ヒートショック
 ↓on ice 2min
 ↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
 ↓37℃で1h、振とう培養
 ↓培養後、全量をLBプレート(+amp)に撒き、37℃でOvernight
(2) pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク
 pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)をそれぞれ、LBプレート(+amp)に白金耳を用いて、ストリークした
↓37℃でインキュベート 
(3) pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ
 E4が15mLチューブに出切りDNAが完全に溶出し終わってからisopropanol 3.5mLを加えた
 ↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した
 ↓遠心後、上清を捨てた
 ↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥した
 ↓TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵した
 ↓この吸光度を計測した
(4) PoxyR、acrABのPCRと電気泳動
 PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った
<組成>
PrimerF各1.5μL
PrimerR各1.5μL
テンプレートDNA
(DH5α、JM109)
1μL
Buffer for KOD-Plus5μL
2mM dNTPs5μL
2mM MgSO42μL
KOD-Plus(1U/μL)1μL
MilliQ33μL
<設定>
Pre Denature94℃2min
Denature94℃15sec
Annealing62.8℃30sec
Extension68℃20sec
4℃
 PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした
    DNA量 5μL
    Loading Buffer 1μL
 の割合で、1%アガロースゲルを用いて100Vで15分間泳動した
(5) コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)
 前日から振とう培養させておいたDH5αの濁度を測定すると、
 0.9と理想の数値O.D=0.4~0.8からはずれていたので、
 全量250mlのうち125mlを残してそれにSOB培地125ml加えて更に2時間振とう培養した
 ↓濁度を測定すると、0.92とまた増えすぎていたので、
  全量250mlのうち125ml残してそれにSOB培地125ml加えて薄めた
 ↓濁度を測定すると0.576で理想値に近づいたのでこのまま実験を行った
 ↓遠心管に移して氷上10分間放置した
 ↓4℃、4500rpmで10分間遠心した
 ↓上清を捨てて沈殿に84mlの氷令したTBに懸濁した
 ↓4℃、4500rpmで10分間遠心した
 ↓上清を捨てて沈殿を20mlの氷令したTB(Transformation Buffer)に懸濁した
 ↓1.5mlのDMSO(7%)を加え氷上で10分間放置した
 ↓1.5mlエッペンチューブに300µlずつ分注し液体窒素の中に放り込んだ
 ↓完成したコンピタントセルDH5αの形質転換効率を計るためにpUC19のベクターを用いて形質転換を行った
 ↓各濃度のpUC19(0.005(ng/µl))、pUC19(0.05(ng/µl))、pUC19(0.5(ng/µl))を1µlと、
  作成したコンピタントセルDH5α 100µlを混ぜた
 ↓15分間氷上に放置した
 ↓42℃で40秒間熱ショックを与えた
 ↓10分間氷上に放置した
 ↓4℃で保存した
 ↓アンピシリン入りのLB(+amp)プレートに全量播いた
 ↓37℃で一晩インキュベートした

Result

(1) 十分な数のコロニーを確認できた
(2) シングルコロニーを得るのに十分な発育が確認できた
(3) 濁度を測定した結果を以下の表にまとめた
pSB1A2pSB1C3
1回目0.1040.051
2回目0.1030.033
3回目0.1200.046
4回目0.1150.052
5回目0.1220.030
平均0.1130.0424
これよりpsB1A2のプラスミドの濃度は565ng/μLである

この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

これよりpSB1C3のプラスミドの濃度は212 ng/μLである
この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

(4) PoxyRとAcrABの十分なバンドを確認することはできなかった
これはAnnealingの温度、もしくはマグネシウムの量が不十分であった可能性が考えられる
後日、Extensionが不十分であったことも判明した
(5) 形質転換効率はまだ導き出されてないコンピタントセルDH5αが完成した
20日にコロニー数を数えて形質転換効率を計測する