"

From 2010.igem.org

Augsut 19

Time

9:00～

Member

岩城、古道、竹内、中村

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Title

(1)　pSB1A2(I13522）とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク　[中村]

(3)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0420）のミディプレ(18日の続き)　[中村]

(4)　プロモーター（PoxyR、acrAB）のPCRと電気泳動　[竹内]

(5)　コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)　[古道]

Purpose

1. Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells.[Nakamura]
2. Picking up single colony of pSB1A2(I732019,I732950) and pSB4A5(K193602).[Nakamura]
3. DNA midiprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0420).[Nakamura]
4. Increasing promoter by PCR and checking by agarose gel electrophoresis.[Takeuchi]
5. Preparing chemically competent cells.[Furumichi]

(1)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のシングルコロニーを得る

(3)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ

(4)　プロモーター(PoxyR、acrAB)を増やし、それを確認する

(5)　18日の続きのコンピタントセル(DH5α)の調整を行う

Method

(1)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション

　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解

　↓DH5α100μLに対し、l13522[2-(8A)]及び、R0040(1-6I)各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合

　↓on　ice　30min

　↓45℃で45sec、ヒートショック

　↓on　ice　2min

　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた

　↓37℃で1h、振とう培養

　↓培養後、全量をLBプレート(+amp)に撒き、37℃でOvernight

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)のストリーク

　pSB1A2(I732019,I732950)、pSB4A5(K193602)をそれぞれ、LBプレート(+amp)に白金耳を用いて、ストリークした

↓37℃でインキュベート　

(3)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0420)のミディプレ

　E4が15mLチューブに出切りDNAが完全に溶出し終わってからisopropanol 3.5mLを加えた

　↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥した

　↓TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵した

　↓この吸光度を計測した

(4)　PoxyR、acrABのPCRと電気泳動

　PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った

＜組成＞ PrimerF 各1.5μL PrimerR 各1.5μL テンプレートDNA (DH5α、JM109) 1μL Buffer for KOD-Plus 5μL 2mM dNTPs 5μL 2mM MgSO4 2μL KOD-Plus(1U/μL) 1μL MilliQ 33μL

＜設定＞ Pre　Denature 94℃ 2min Denature 94℃ 15sec Annealing 62.8℃ 30sec Extension 68℃ 20sec 4℃ ∞

　PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした

　　　　DNA量　5μL

　　　　Loading Buffer　1μL

　の割合で、1%アガロースゲルを用いて100Vで15分間泳動した

(5)　コンピタントセル(DH5α)の調整(18日の続き)

　前日から振とう培養させておいたDH5αの濁度を測定すると、

　0.9と理想の数値O.D＝0.4～0.8からはずれていたので、

　全量250mlのうち125mlを残してそれにSOB培地125ml加えて更に2時間振とう培養した

　↓濁度を測定すると、0.92とまた増えすぎていたので、

　　全量250mlのうち125ml残してそれにSOB培地125ml加えて薄めた

　↓濁度を測定すると0.576で理想値に近づいたのでこのまま実験を行った

　↓遠心管に移して氷上10分間放置した

　↓4℃、4500rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨てて沈殿に84mlの氷令したTBに懸濁した

　↓4℃、4500rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨てて沈殿を20mlの氷令したTB(Transformation Buffer)に懸濁した

　↓1.5mlのDMSO(7％)を加え氷上で10分間放置した

　↓1.5mlエッペンチューブに300µlずつ分注し液体窒素の中に放り込んだ

　↓完成したコンピタントセルDH5αの形質転換効率を計るためにpUC19のベクターを用いて形質転換を行った

　↓各濃度のpUC19(0.005(ng/µl))、pUC19(0.05(ng/µl))、pUC19(0.5(ng/µl))を1µlと、

　　作成したコンピタントセルDH5α 100µlを混ぜた

　↓15分間氷上に放置した

　↓42℃で40秒間熱ショックを与えた

　↓10分間氷上に放置した

　↓4℃で保存した

　↓アンピシリン入りのLB(+amp)プレートに全量播いた

　↓37℃で一晩インキュベートした

Result

(1)　十分な数のコロニーを確認できた

(2)　シングルコロニーを得るのに十分な発育が確認できた

(3)　濁度を測定した結果を以下の表にまとめた

pSB1A2 pSB1C3 1回目 0.104 0.051 2回目 0.103 0.033 3回目 0.120 0.046 4回目 0.115 0.052 5回目 0.122 0.030 平均 0.113 0.0424

これよりpsB1A2のプラスミドの濃度は565ng/μLである この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した これよりpSB1C3のプラスミドの濃度は212 ng/μLである この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

(4)　PoxyRとAcrABの十分なバンドを確認することはできなかった

これはAnnealingの温度、もしくはマグネシウムの量が不十分であった可能性が考えられる

後日、Extensionが不十分であったことも判明した

(5)　形質転換効率はまだ導き出されてないコンピタントセルDH5αが完成した

20日にコロニー数を数えて形質転換効率を計測する