"
Team:Warsaw/Calendar-Stage1/12 July 2010
From 2010.igem.org
Monday, 12 June 2010
1. Finish the alkaline lysis from Saturday 10.07, samples: 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1
2. Digest sample 12.1 J23100[synthetic promoter] with SpeI(Bcu)+ PstI,
Gel electrophoresis [Fig X]
3. Digest community RBSes-GFP-terminator, samples: 7.2 G, 8.1 E, 9.1 A, 11.1 P, 10.1 F with XbaI + PstI
Gel electrophoresis {Fig X]
Ligation of sample 12.1 J23100 [promoter] with the community RBSes-GFP-terminator samples: 7.2 G, 8.1 E, 9.1 A, 11.1 P, 10.1 F
4. Digest 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1 (RBS Andersona + GFP) [Eco +Pst] w celu sprawdzenia poprawności konstruktów. Elektroforeza.
Wszystkie klony są poprawne ( potrzebne zdjęcie żelu!) Elektroforeza – zdjęcie (opis zdjęć wg kolejności naniesionych próbek): 1-szy żel: 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1 2-gi żel: 7.2, 8.1, 9.1, 10.1 3-ci żel: 11.1, 12.1
______________________________________________
Digest conditions, used for all reactions:
8 μl DNA
2 μl BamHI buffer
10 μl H2O
0,3 μl enzymów
20 μl final volume
digest for 3h
Ligation conditions, used for all reactions:
25ul insert DNA
2ul vector DNA
3ul ligase buffer
30 ul final volume
overnight ligation
Cloning GFP+terminator behind Anderson's RBSes
1. Finish the alkaline lysis from Saturday 10.07, samples: 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1
Cloning Connumity RBSes+GFP+terminator behind 23100
2. Digest sample 12.1 J23100[synthetic promoter] with SpeI(Bcu)+ PstI,
Gel electrophoresis [Fig X]
3. Digest community RBSes-GFP-terminator, samples: 7.2 G, 8.1 E, 9.1 A, 11.1 P, 10.1 F with XbaI + PstI
Gel electrophoresis {Fig X]
Ligation of sample 12.1 J23100 [promoter] with the community RBSes-GFP-terminator samples: 7.2 G, 8.1 E, 9.1 A, 11.1 P, 10.1 F
4. Digest 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1 (RBS Andersona + GFP) [Eco +Pst] w celu sprawdzenia poprawności konstruktów. Elektroforeza.
Wszystkie klony są poprawne ( potrzebne zdjęcie żelu!) Elektroforeza – zdjęcie (opis zdjęć wg kolejności naniesionych próbek): 1-szy żel: 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1 2-gi żel: 7.2, 8.1, 9.1, 10.1 3-ci żel: 11.1, 12.1
Cloning fluorescent proteins behind expression vector 3.1 and behind promoter J23100
5. Digest part part 3.1 – Anderson RBS from distribution (expression vector = promoter J23100+RBS) with SpeI and PstI
6. Digest fluorescent proteins with XbaI and PstI, klonujemy pod wektor ekspresyjny. Białka fluorescencyjne:
- GFP E240
- CFP E0420
- YFP E0430
- mOrange E2050* / klonujemy bez RBS-u
- mCherry J67102*/ klonujemy bez RBS-u
- mCherry NLS J130012
* może zawierac internal RBS. Sprawdzic – podklonowac pod promotor.
Gel – out tych bricków, ligacja z wektorem ekspresyjnym i transformacja
______________________________________________
Digest conditions, used for all reactions:
8 μl DNA
2 μl BamHI buffer
10 μl H2O
0,3 μl enzymów
20 μl final volume
digest for 3h
Ligation conditions, used for all reactions:
25ul insert DNA
2ul vector DNA
3ul ligase buffer
30 ul final volume
overnight ligation
blablabla temat2
