Template:KIT-Kyoto-Augsut22

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August 22

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Time

9:00～

Member

古道、臼井、中村、足立
Furumichi,Usui,Nakamura,Adachi

Title

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動　[足立、臼井]
(2)　pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のプレカルチャー　[臼井]
(3)　AcrAB,oxyRのPCR　[臼井]

Purpose

  1. Agarose gel electrophoresis of AcrAB and OxyR.[Adachi,Usui]
  2. Pre-culture of pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950).[Usui]
  3. PCR of AcrAB and OxyR.[Usui]
(1)　PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック
(2)　pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)の培養
(3)　AcrAB,oxyRのPCR

Method

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動
　8月21日(土)にPCRで複製したAcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を
　各4本ずつ計12本電気泳動を行うことによりPCR産物の複製の程度を調べた
　AcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を
　各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した
　↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った
　↓EtBr(10mg/ml)で20分間染色した
　↓泳動結果を写真撮影した
※結果は写真参照
(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー
　プレート培地上からpSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のシングルコロニーをピックアップした
　↓各2本ずつ、3mLの液体LB培地(+amp)を使用し、37℃で振とう培養した(overnight)
(3)　AcrAB,oxyRのPCR
　AcrAB,oxyRに関して8月21日の実験結果より
　以下のようにMg4μL、テンプレートDNA1μLの試薬組成でAcrAB,oxyRのプロモーターを大量に複製した
＜PCR試薬組成＞
PrimerF1.5μL
PrimerR1.5μL
dNTPs5μL
KOD-Plus- Buffer5μL
テンプレートDNA
(DH5α,JM109)		1μL
MgSO44μL
H2O31μL
KOD-Plus-1μL
total50μL
＜設定＞
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃62.8℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec20sec2min保持
35サイクル

Results

(1)　8月21日(土)のPCR試薬組成(2)で電気泳動をしたところ、
　　AcrAB(DH5α)
　　AcrAB(JM109)
　　oxyR(DH5α)
　　oxyR(JM109)
それぞれでバンドが確認できなかった
(2)　翌日pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)は培養が成功していたので、
後日使うまで、冷蔵保存しておいた
(3)　詳しい結果は23日(2)に掲載した
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