Template:KIT-Kyoto-Augsut22

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August 22

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Time

9:00~

Member

古道、臼井、中村、足立
Furumichi,Usui,Nakamura,Adachi

Title

(1) PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動 [足立、臼井]
(2) pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のプレカルチャー [臼井]
(3) AcrAB,oxyRのPCR [臼井]

Purpose

  1. Agarose gel electrophoresis of AcrAB and OxyR.[Adachi,Usui]
  2. Pre-culture of pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950).[Usui]
  3. PCR of AcrAB and OxyR.[Usui]
(1) PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック
(2) pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)の培養
(3) AcrAB,oxyRのPCR

Method

(1) PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動
 8月21日(土)にPCRで複製したAcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を
 各4本ずつ計12本電気泳動を行うことによりPCR産物の複製の程度を調べた
 AcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を
 各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した
 ↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った
 ↓EtBr(10mg/ml)で20分間染色した
 ↓泳動結果を写真撮影した
※結果は写真参照
(2) pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー
 プレート培地上からpSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のシングルコロニーをピックアップした
 ↓各2本ずつ、3mLの液体LB培地(+amp)を使用し、37℃で振とう培養した(overnight)
(3) AcrAB,oxyRのPCR
 AcrAB,oxyRに関して8月21日の実験結果より
 以下のようにMg4μL、テンプレートDNA1μLの試薬組成でAcrAB,oxyRのプロモーターを大量に複製した
<PCR試薬組成>
PrimerF1.5μL
PrimerR1.5μL
dNTPs5μL
KOD-Plus- Buffer5μL
テンプレートDNA
(DH5α,JM109)
1μL
MgSO44μL
H2O31μL
KOD-Plus-1μL
total50μL
<設定>
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃62.8℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec20sec2min保持
35サイクル

Results

(1) 8月21日(土)のPCR試薬組成(2)で電気泳動をしたところ、
  AcrAB(DH5α)
  AcrAB(JM109)
  oxyR(DH5α)
  oxyR(JM109)
それぞれでバンドが確認できなかった
(2) 翌日pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)は培養が成功していたので、
後日使うまで、冷蔵保存しておいた
(3) 詳しい結果は23日(2)に掲載した