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Template:KIT-Kyoto-Augsut27
From 2010.igem.org
August 27
Time
- 9:00～
Member
- 福山,竹内,臼井
- Fukuyama,Takeuchi,Usui
Purpose
- (1) psB6A1(K121013)のミニプレ [竹内]
- (2) エチジウムブロマイドの作成
Method
- (1) psB6A1(K121013)のミニプレ
- psB6A1(K121013)24mL分を分注した
- ↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌し、エッペン２本分にした
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心５分（20℃、14500rpm）
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分（20℃、14500rpm）
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）
- ↓溶出液を回収
- ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
- ↓遠心１０分（4℃、14000rpm）
- ↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。
- ↓遠心5分（4℃、14000rpm）
- ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
- ↓MilliQを30μl加えた
- ↓二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した
- Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
- (マーカーは1kbp radderを使用した)
- ↓100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
- ↓泳動結果を写真で撮影した
- (2) エチジウムブロマイドの作成
- MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液（0.44mg/mL）を１滴加えた
Results
- (１) 十分に濃いバンドが確認できた
- これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる
- (２) １滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに３滴付加したところ十分に使用できるようになった
Consideration
- (１) 次回からは１００倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき
- (２) これより40mL分を作る時は少なくとも４滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる
