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From 2010.igem.org

August 27

Time

9:00～

Member

福山,竹内,臼井

Fukuyama,Takeuchi,Usui

Purpose

1. DNA miniprep of psB6A1(K121013).[Takeuchi]
2. Making of EtBr.[Takeuchi]

(1)　psB6A1(K121013)のミニプレ　[竹内]

(2)　エチジウムブロマイドの作成　[竹内]

Method

(1)　psB6A1(K121013)のミニプレ

　psB6A1(K121013)24mL分を分注した

　↓遠心1分(20℃、14500rpm)して集菌し、エッペン2本分にした

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓遠心5分(4℃、14000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓MilliQを30μl加えた

　↓二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した

　　Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した

　　(マーカーは1kbp radderを使用した)

　　↓100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色

　　↓泳動結果を写真で撮影した

(2)　エチジウムブロマイドの作成

MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液(0.44mg/mL)を1滴加えた

Results

(1)　十分に濃いバンドが確認できた

これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる

(2)　1滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに3滴付加したところ十分に使用できるようになった

Consideration

(1)　次回からは100倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき

(2)　これより40mL分を作る時は少なくとも4滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる