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Template:KIT-Kyoto-Augsut24
From 2010.igem.org
August 24
Time
- 9:00～21:00
Member
- 岩城,竹内,中村,臼井,吉村
- Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Yoshimura
Purpose
- The survivorship curve of E. coli is examined. [Yoshimura]
- Confirmation of PCR products(dps and AcrAB) by Agarose gel electrophoresis.[Nakamura,Usui]
- Dps and AcrAB digestion by restriction enzymes.[Nakamura,Usui]
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる(2日目) [吉村]
- (2) dps、acrABの電気泳動によるPCRの確認 [中村、臼井]
- (3) dps、acrABの制限酵素処理 [中村、臼井]
Method
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる(2日目)
- 前日にプレカルチャーしたLB 2 mlにLB(-amp)(2ml)を加え濃度調整、濁度を計った
- ↓O.D.600=0.4~0.6まで培養することを目的とした
- 10:00 O.D.600=0.310
- 11:30 O.D.600=0.908 (濁度が高すぎたため、この溶液5mlをLB20mlに植え継ぎ培養しなおした)
- 11:50 O.D.600=0.152
- 13:00 O.D.600=0.502 (目的の濃度に達したため、培養を停止した)
- ↓培養後、2mlずつ分注し、それぞれにH2O2を加えた
- ↓加えた後、37℃で1時間培養した
- ↓培養後、LB1mlに培養液をそれぞれ1μlずつ分注し、その内10μlをLBプレートにまいた
- ↓37℃でインキュベートを行った(overnight)
- (2) dps、acrABの電気泳動
- 前日にPCRしておいたdps、acrAB(50μL×2本ずつ)を電気泳動し、EtBr処理の後、写真を撮影した
- その条件を以下に示す
- ＜条件＞
- DNA 10μL
- 1％アガロースゲルで135V、15min
- EtBr処理 10min
- (3) dps、acrABの制限酵素処理
- PCR後のdps、acrABをライゲーション用に制限酵素処理を行った
- 制限酵素処理の組成を以下に示す
- ＜組成＞
- DNAsol 40μL
- 1×H．Buffer 5μL
- EcoRⅠ 1μL
- SpeⅠ 1μL
- H2O 3μL
- これを、37℃で3.5hインキュベートした後、冷蔵保存した
Results
- (1) 実験結果は25日に記載
- (2) 薄いバンドが目的の位置に確認された
- ＊詳細は写真参照
- (3) 制限酵素処理済のdps、acrABは25日にライゲーションを行う予定
