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From 2010.igem.org

August 24

Time

9:00～21:00

Member

岩城,竹内,中村,臼井,吉村

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Yoshimura

Purpose

1. The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
2. Confirmation of PCR products(dps and AcrAB) by Agarose gel electrophoresis.[Nakamura,Usui]
3. Dps and AcrAB digestion by restriction enzymes.[Nakamura,Usui]

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる(2日目)　[吉村]

(2)　dps、acrABの電気泳動によるPCRの確認　[中村、臼井]

(3)　dps、acrABの制限酵素処理　[中村、臼井]

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる(2日目)

　前日にプレカルチャーしたLB 2 mlにLB(-amp)(2ml)を加え濃度調整、濁度を計った

　↓O.D.600=0.4~0.6まで培養することを目的とした

　　10:00　O.D.600=0.310

　　11:30　O.D.600=0.908　(濁度が高すぎたため、この溶液5mlをLB20mlに植え継ぎ培養しなおした)

　　11:50　O.D.600=0.152

　　13:00　O.D.600=0.502　(目的の濃度に達したため、培養を停止した)

　↓培養後、2mlずつ分注し、それぞれにH2O2を加えた

　↓加えた後、37℃で1時間培養した

　↓培養後、LB1mlに培養液をそれぞれ1μlずつ分注し、その内10μlをLBプレートにまいた

　↓37℃でインキュベートを行った(overnight)

(2)　dps、acrABの電気泳動

　前日にPCRしておいたdps、acrAB(50μL×2本ずつ)を電気泳動し、EtBr処理の後、写真を撮影した

　その条件を以下に示す

＜条件＞

DNA 10μL

1％アガロースゲルで135V、15min

EtBr処理　10min

(3)　dps、acrABの制限酵素処理

　PCR後のdps、acrABをライゲーション用に制限酵素処理を行った

　制限酵素処理の組成を以下に示す

＜組成＞

DNAsol　40μL

1×H．Buffer　5μL

EcoRⅠ　1μL

SpeⅠ　1μL

H₂O　3μL

これを、37℃で3.5hインキュベートした後、冷蔵保存した

Results

(1)　実験結果は25日に記載

(2)　薄いバンドが目的の位置に確認された

＊詳細は写真参照

(3)　制限酵素処理済のdps、acrABは25日にライゲーションを行う予定