"
Template:KIT-Kyoto-Augsut23
From 2010.igem.org
Revision as of 09:00, 11 September 2010 by Matsubara3 (Talk | contribs)
August 23
【時間】
- 9:00～21:00
【実験担当】
- 岩城,竹内,中村,臼井,吉村
【実験名】
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる
- (2) dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック
- (3) dps,acrABのDNA濃度測定
【実験目的】
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)
- (2) 活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック
- (3) dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。
【実験内容】
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる
- 30％ H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくった
- ↓4M H2O2(250μl)とミリQ(750μl)で1MのH2O2をつくった
- ↓以下10倍希釈していき、1nM H2O2まで作成した
- 次にDH5αのシングルコロニーをピックアップした
- ↓LB(-amp)2mlでプレカルチャーを行った
- ↓(37℃でインキュベート、overnight)
- (2) dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック
- dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCRを以下の組成、設定で行った
＜組成＞ (dps,grxA,trxC) (oxyR) PrimerR 1.5μL PrimerR 3μL PrimerF 1.5μL PrimerF 3μL dNTP 5μL dNTP 20μL Buffer 5μL Buffer（KOD－FX） 50μL DNA（DH5α） 0.5μL DNA（DH5α） 2μL MgSO4 4μL MilliQ 20μL MilliQ 31.5μL KOD－FX 2μL KOD－Plus 1μL 全量 50μL 全量 100μL ＜PCRの設定＞ (dps,grxA ,trxC) (oxyR) 1．Pre Penature 94℃―2min 94℃―2min 2．Denature 94℃―15sec 94℃―10sec 3．Annealing 59.7℃―30sec 52℃―30sec 4．Extension 68℃―30sec 68℃―45sec 5．+Extension 68℃ー2min 68℃ー2min
- またPCR後、それぞれ電気泳動によるチェックを以下の条件で行った。
- 1回目 100V、20min EtBr 20min
- 2回目 135V、15min EtBr 10min
- (3) dps,acrABのDNA濃度測定
- 吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった。
【実験結果】
- (1) 実験結果は25日のノートに記載した。
- (2) 1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった。
- 2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった。
- ＊詳細は写真参照
- (3) 吸光度の測定結果
- 以下の吸光度の結果から、PCRに十分と判断された。
吸光度 dps acrAB 1回目 0.340 0.565 2回目 0.329 0.555 3回目 0.314 0.556 4回目 0.309 0.556 5回目 0.312 0.551 平均値 0.321 0.557
