Template:KIT-Kyoto-Augsut23

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August 23

Time

9:00～21:00

Member

岩城,竹内,中村,臼井,吉村

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Yoshimura

Title

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる　[吉村]　

(2)　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック　[中村、臼井]

(3)　dps,acrABのDNA濃度測定　[中村、臼井]

Purpose

1. The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
2. PCR of dps,AcrAB,trxC,and OxyR.And Comfirm those by agarose gel electrophoresis.[Nakamura,Usui]
3. Measurement of density of DNA of dps and acrAB.[Nakamura,Usui]

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

(2)　活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック

(3)　dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

　30％ H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくった

　↓4M H2O2(250μl)とミリQ(750μl)で1MのH2O2をつくった

　↓以下10倍希釈していき、1nM H2O2まで作成した

　次にDH5αのシングルコロニーをピックアップした

　↓LB(-amp)2mlでプレカルチャーを行った

　↓(37℃でインキュベート、overnight)

(2)　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック

　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCRを以下の組成、設定で行った

＜組成＞ (dps,grxA,trxC) (oxyR) PrimerR 1.5μL PrimerR 3μL PrimerF 1.5μL PrimerF 3μL dNTP 5μL dNTP 20μL Buffer 5μL Buffer（KOD－FX） 50μL DNA（DH5α） 0.5μL DNA（DH5α） 2μL MgSO4 4μL MilliQ 20μL MilliQ 31.5μL KOD－FX 2μL KOD－Plus 1μL 全量 50μL 全量 100μL

＜PCRの設定＞ (dps,grxA ,trxC) (oxyR) 1．Pre　Penature 94℃―2min 94℃―2min 2．Denature 94℃―15sec 94℃―10sec 3．Annealing 59.7℃―30sec 52℃―30sec 4．Extension 68℃―30sec 68℃―45sec 5．+Extension 68℃ー2min 68℃ー2min またPCR後、それぞれ電気泳動によるチェックを以下の条件で行った 　1回目　100V、20min　EtBr　20min 　2回目　135V、15min　EtBr　10min

(3)　dps,acrABのDNA濃度測定

　吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった

Results

(1)　実験結果は25日のノートに記載した

(2)　1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった

2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった

＊詳細は写真参照

(3)　吸光度の測定結果

以下の吸光度の結果から、PCRが十分と判断された

吸光度	dps	acrAB
1回目	0.340	0.565
2回目	0.329	0.555
3回目	0.314	0.556
4回目	0.309	0.556
5回目	0.312	0.551
平均値	0.321	0.557

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