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Template:KIT-Kyoto-Augsut27
From 2010.igem.org
August 27
【時間】 9:00～
【実験担当】福山,竹内,臼井
【実験目的】 (1)K121013(on psB6A1)のミニプレ (2)エチジウムブロマイドの作成
【実験内容】 (1) K121013(on psB6A1)24mL分を分注した。
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遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌し、エッペン２本分にした
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上清を捨てた
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SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
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SolutionⅡを250μl加えた
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SolutionⅢを350μl加えた
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遠心５分（20℃、14500rpm）
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上清をカラムに入れた
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遠心３０秒（20℃、14500rpm）
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抽出液を捨てた
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SolutionⅣを500μlカラムに加えた
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遠心1分（20℃、14500rpm）
↓
抽出液を捨てた
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SolutionⅤを700μlカラムに加えた
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遠心３０秒（20℃、14500rpm）
↓
抽出液を捨てた
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遠心３０秒（20℃、14500rpm）
↓
抽出液を捨てた
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滅菌水をカラムに入れた
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遠心３０秒（20℃、14500rpm）
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溶出液を回収
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酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、
それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
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遠心１０分（4℃、14000rpm）
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上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。
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遠心5分（4℃、14000rpm）
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上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
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MilliQを30μl加えた ↓ 二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した。
Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
(マーカーは1kbp radderを使用した)
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100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
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泳動結果を写真で撮影した
（２）
MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液（0.44mg/mL）を１滴加えた。
【実験結果】 (１)十分に濃いバンドが確認できた これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる 次回からは１００倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき
(２) １滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに３滴付加したところ十分に使用できるようになった これより40mL分を作る時は少なくとも４滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる
