Template:KIT-Kyoto-Augsut23

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August 23

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【時間】　9:00～21:00

【実験担当】岩城,竹内,中村,臼井,吉村

【実験名】
(1)大腸菌の生存曲線を調べる
(2)dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック
(3)dps,acrABのDNA濃度測定
【実験目的】
(1)大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)
(2)活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック
(3)dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。
【実験内容】
(1)30％ H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくる
　　↓
　　4M H2O2(250μl)とミリQ(750μl)で1MのH2O2をつくる
　　↓
　　以下10倍希釈していき、1nM H2O2まで作成。

　　次にDH5αのシングルコロニーをピックアップ
　　↓
　　LB(-amp)(2ml)でプレカルチャー(37℃でインキュベート、overnight)

(2)dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCRを以下の組成、設定で行った。

〈組成〉（dps,grxA,trxC）　　　　　〈組成〉（oxyR）
・PrimerR・・・・・・・1.5μL　　　　　　　・PrimerR・・・・・・・・・・・・3μL
・PrimerF・・・・・・・1.5μL　　　　 　　・PrimerF・・・・・・・・・・・・・3μL
・dNTP・・・・・・・・5μL　　　　　 　　・dNTP・・・・・・・・・・・・・・・20μL
・Buffer・・・・・・・5μL　　　 　　　　・Buffer（KOD－FX）・・・50μL
　　　　　　　　　 ・DNA（DH5α）・・・0.5μL　　　　 　　・DNA（DH5α）・・・・・・・・2μL
・MgSO4・・・・・・・4μL　　　　　　 　・MilliQ・・・・・・・・・・・・・・20μL
・MilliQ・・・・・・・・・・31.5μL　 　　　・KOD－FX・・・・・・・・・・・2μL
・KOD－Plus・・・・・・・1μL
全量・・・・・・・・・・・・50μL　　　　　　　全量・・・・・・・・・・・・・・・100μL

〈PCRの設定〉
　　　　　　　　　　　　　　　 1．Pre　Penature・・・94℃―2min　　　　　1．Pre　Penature・・・94℃―2min
2．Denature・・・・・・・94℃―15sec　　　　　2．Denature・・・・・・・94℃―10sec
3．Annealing・・・・・・59.7℃―30sec　　　　3．Annealing・・・・・・52℃―30sec
4．Extension・・・・・・68℃―30sec　　　　　4．Extension・・・・・・68℃―45sec
5．+Extension・・・・・68℃ー2min　　　　　5．+Extension・・・・・68℃ー2min
＊dps、grxA 、trxC　　　　　　　　　　　　＊oxyR
またPCR後、それぞれ電気泳動によるチェックを1回目　100V、20min　EtBr　20min
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2回目　135V、15min　EtBr　10min　で行った。

(3)吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった。

【実験結果】
(2)1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった。
2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった。
＊詳細は写真参照

(3)吸光度の測定結果
以下の吸光度の結果から、PCRに十分と判断された。
吸光度 dps acrAB
1回目 0.340 0.565
2回目 0.329 0.555
3回目 0.314 0.556
4回目 0.309 0.556
5回目 0.312 0.551
平均値 0.321 0.557