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From 2010.igem.org

August 22

Time

9:00～

Member

古道、臼井、中村、足立

Furumichi,Usui,Nakamura,Adachi

Title

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動　[足立、臼井]

(2)　pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のプレカルチャー　[臼井]

(3)　AcrAB,oxyRのPCR　[臼井]

Purpose

(1)　PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック

(2)　pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)の培養

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

Method

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動

　8月21日(土)にPCRで複製したAcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を

　各4本ずつ計12本電気泳動を行うことによりPCR産物の複製の程度を調べた

　AcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を

　各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した

　↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った

　↓EtBr(10mg/ml)で20分間染色した

　↓泳動結果を写真撮影した

※結果は写真参照

(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー

　プレート培地上からpSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のシングルコロニーをピックアップした

　↓各2本ずつ、3mLの液体LB培地(+amp)を使用し、37℃で振とう培養した(overnight)

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

　AcrAB,oxyRに関して8月21日の実験結果より

　以下のようにMg4μL、テンプレートDNA1μLの試薬組成でAcrAB,oxyRのプロモーターを大量に複製した

＜PCR試薬組成＞ PrimerF 1.5μL PrimerR 1.5μL dNTPs 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL テンプレートDNA (DH5α,JM109) 1μL MgSO4 4μL H2O 31μL KOD-Plus- 1μL total 50μL

＜設定＞ Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 94℃ 94℃ 62.8℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 20sec 2min 保持 35サイクル

Results

(1)　8月21日(土)のPCR試薬組成(2)で電気泳動をしたところ、

　　AcrAB(DH5α)

　　AcrAB(JM109)

　　oxyR(DH5α)

　　oxyR(JM109)

それぞれでバンドが確認できなかった

(2)　翌日pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)は培養が成功していたので、

後日使うまで、冷蔵保存しておいた

(3)　詳しい結果は23日(2)に掲載した