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From 2010.igem.org

August 22

【時間】

9:00～

【実験担当】

古道、臼井、中村、足立

【実験名】

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動

(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

【実験目的】

(1)　PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック

(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]の培養

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

【実験内容】

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動

　8月21日(土)にPCRで複製したAcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を

　各4本ずつ計12本電気泳動を行うことによりPCR産物の複製の程度を調べた

　AcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を

　各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した

　↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った

　↓EtBr染色(10mg/ml)を20分間行った

　↓泳動結果を写真撮影した

(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー

　プレート培地上のコロニーからpSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]をピックアップし、

　各2本ずつ、3mLの液体LB培地を使用して37℃で振とう培養した(overnight)

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

AcrAB,oxyRに関して、以下の条件で大量に複製した 実験(1)で8月21日(土)の試薬組成を試したところ結果が良好であったため、それを用いて実験を行った ＊()内の番号については、21日のPCR試薬組成表と対応している 　　　AcrAB(DH5α)――――(2) 　　　AcrAB(JM109)――――(2) 　　　oxyR(DH5α)――――(2) 　　　oxyR(JM109)――――(2)

＜PCRの試薬組成＞

 AcrAB 
oxyR 

PrimerF 1.5μL 1.5μL PrimerR 1.5μL 1.5μL dNTPs 5μL 5μL KOD-Plus- Buffer

5μL 5μL 

テンプレートDNA (DH5α,JM109) 1μL 1μL MgSO4 4μL 4μL H2O 31μL 31μL KOD-Plus- 1μL 1μL

total 50μL 50μL

＜設定＞ Pre　Denature・・・94℃、2min

35Cycles↓ ・Denature・・・・・・・94℃、15sec ・Annealing・・・・・・62.8℃、30sec ・Extension・・・・・・68℃、20sec

+Extension・・・・・・68℃、2min　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　 4℃、∞

【実験結果】 (1)8月21日(土)の試薬組成 　・AcrAB(DH5α)の(2) 　・AcrAB(JM109)の(2) 　・oxyR(DH5α)の(2) 　・oxyR(JM109)の(2) 　でバンドがはっきりと確認できた。

(2)翌日pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ] は培養が成功していたので、後日使うまで、冷蔵保存しておいた。

(3)23日(2)に掲載した。