Template:KIT-Kyoto-Augsut21

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Revision as of 11:08, 3 October 2010

August 21

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Time

9:00～

Member

竹内、革島、足立、吉村

Takeuchi,Kawashima,Adachi,Yoshimura

Title

(1)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動　[革島 ]

(2)　pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ　[足立,吉村]

(3)　AcrAB,PoxyのPCR　[竹内]

Purpose

(1)　DH５αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック

(2)　DH５α(R0040),DH５α(I13522)のプラスミド抽出

(3)　AcrAB,PoxyのPCR

Method

(1)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動

　8月20日(金)にアルカリミニプレップによって取り出したプラスミド、

　DNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))の確認を電気泳動によって行った

　pSB6A1(K121013)(左から2~5番目のコーム),

　pSB6A1(J04450)(左から6~8番目のコーム)を5μLずつ、

　それぞれLoading Buffer 1μLを加え6倍希釈にしコームに流した

　↓1kbp radder(1番左のコーム)をマーカーとして使用し、100vで25分間電気泳動を行った

　↓EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min

　↓泳動結果を写真撮影した

(2)　pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ

　8月20日(金)に培養したpSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)

　↓5分間、氷上で放置した

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)

　↓5分間、氷上で放置した

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)のイソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心

　↓30秒間、遠心乾燥を行った

　↓RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAとした

　制限酵素処理と電気泳動

右の表に従い試薬を調整し、これを37℃で1時間インキュベートした
↓Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した
　(マーカーは1kbp radderを使用した)
↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
↓泳動結果を写真で撮影した

＜試薬組成＞
EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL
プラスミドDNA (DH５α(R0040),DH５α(I13522))	5μL
H₂O	11μL
H Buffer	2μL
計	20μL

(3)　AcrAB,PoxyのPCR

　以下の試薬組成、プログラムに従ってPCRを行った

試薬組成
	(1)	(2)	(3)
テンプレートDNA(DH5α)	1μL	1μL	2μL
MgSO₄	2μL	4μL	3μL
primer F	1.5μL	1.5μL	1.5μL
primer R	1.5μL	1.5μL	1.5μL
KOD-Plusｰ	1μL	1μL	1μL
H2O	33μL	31μL	32μL
dNTPs	5μL	5μL	5μL
total	50μL	50μL	50μL

Pre Denature	Denature	Annealing	Extention
94℃	94℃	62.8℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	20sec	保持
	35サイクル

　結果は写真参照

Results

(1)　写真の結果

pSB6A1(K121013)のバンドは4つとも見えなかった

　　　→アルカリミニプレップのやり直し

pSB6A1(J04450)の3つのバンドは、3つともバンドが見えた(ただし一番左のみ少し)

pSB6A1(J04450)に関しては十分量DH5αにベクターが組み込まれたとみなし実験でこれを使用した

(2)　DH５α(R0040),DH５α(I13522)それぞれ3種類ずつアプライしたのだが、

全てバンドがはっきりと見えたため、プラスミド挿入が成功していることが確認された

(3) 十分なバンドを確認することができなかった。

Consideration

(1)　pSB6A1(K121013)　→　アルカリミニプレップのやり直し

(3)　テンプレートDNAはもっと少なくするべき

　MgSO4は4 μlでやるべき

　プライマーが間違っている可能性もあり

@@ Line 101: / Line 101: @@
 ::<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>20sec</TD><TD>保持</TD></TR>
 ::<TR>
-::<TD></TD><TD COLSPAN="3">35サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR>
+::<TD></TD><TD COLSPAN="3">35サイクル</TD><TD></TD></TR>
 ::</TABLE>
 ::</TD></TR></TABLE>