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From 2010.igem.org

August 21

Time

9:00～

Member

竹内、革島、足立、吉村

Takeuchi,Kawashima,Adachi,Yoshimura

Title

(1)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動　[革島 ]

(2)　pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ　[足立,吉村]

(3)　AcrAB,PoxyのPCR　[竹内]

Purpose

1. The insertion of pSB6A1(K121013) and pSB6A1(J04450) is confirmed.[Kawashima]
2. DNA miniprep of pSB1A2(R0040) and pSB1A2(I13522).[Adachi,Yoshimura]
3. PCR of AcrAB and OxyR.[Takeuchi]

(1)　DH５αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック

(2)　pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のプラスミド抽出

(3)　AcrAB,PoxyのPCR

Method

(1)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動

　8月20日(金)にアルカリミニプレップによって取り出したプラスミド、

　DNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))の確認を電気泳動によって行った

　pSB6A1(K121013)(左から2~5番目のコーム),

　pSB6A1(J04450)(左から6~8番目のコーム)を5μLずつ、

　それぞれLoading Buffer 1μLを加え6倍希釈にしコームに流した

　↓1kbp radder(1番左のコーム)をマーカーとして使用し、100vで25分間電気泳動を行った

　↓EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min

　↓泳動結果を写真撮影した

(2)　pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ

　8月20日(金)に培養したpSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)

　↓5分間、氷上で放置した

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)

　↓5分間、氷上で放置した

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)のイソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心

　↓30秒間、遠心乾燥を行った

　↓RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAとした

　制限酵素処理と電気泳動

右の表に従い試薬を調整し、これを37℃で1時間インキュベートした ↓Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した 　(マーカーは1kbp radderを使用した) ↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した ↓泳動結果を写真で撮影した

＜試薬組成＞ EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL プラスミドDNA (DH５α(R0040),DH５α(I13522)) 5μL H2O 11μL H Buffer 2μL 計 20μL

(3)　AcrAB,PoxyのPCR

　以下の試薬組成、プログラムに従ってPCRを行った

試薬組成 (1) (2) (3) テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL 2μL MgSO4 2μL 4μL 3μL primer F 1.5μL 1.5μL 1.5μL primer R 1.5μL 1.5μL 1.5μL KOD-Plusｰ 1μL 1μL 1μL H2O 33μL 31μL 32μL dNTPs 5μL 5μL 5μL total 50μL 50μL 50μL

Pre Denature Denature Annealing Extention 94℃ 94℃ 62.8℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 20sec 保持 35サイクル

　結果は写真参照

Results

(1)　写真の結果

pSB6A1(K121013)のバンドは4つとも見えなかった

　　　→アルカリミニプレップのやり直し

pSB6A1(J04450)の3つのバンドは、3つともバンドが見えた(ただし一番左のみ少し)

pSB6A1(J04450)に関しては十分量DH5αにベクターが組み込まれたとみなし実験でこれを使用した

(2)　DH５α(R0040),DH５α(I13522)それぞれ3種類ずつアプライしたのだが、

全てバンドがはっきりと見えたため、プラスミド挿入が成功していることが確認された

(3) 十分なバンドを確認することができなかった。

Consideration

(1)　pSB6A1(K121013)　→　アルカリミニプレップのやり直し

(3)　テンプレートDNAはもっと少なくするべき

　MgSO4は4 μlでやるべき

　プライマーが間違っている可能性もあり