Template:KIT-Kyoto-Augsut17

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【実験目的】
【実験目的】
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:(1)　pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック
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:(1)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する　[革島]
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:(2)　pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ
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:(2)　pSB3K3(J04450),pSB6A(J04450)のプラスミド抽出　[革島]
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:(3)　コンピテントセル(DH5α)の調整
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:(3)　コンピテントセル(DH5α)の調整　[古道、吉村]
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:(4)　DH5α(pSB1A2(12-M),pSB1A3(3-A))のシングルコロニーのピックアップ
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:(4)　pSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のシングルコロニーのピックアップ　[福山]
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:(5)　pSB3K3,pSB6A2のプレカルチャー　[革島]
【実験内容】
【実験内容】
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:(1)　pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック
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:(1)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)のシングルコロニーと制限酵素処理、電気泳動
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::　pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のシングルコロニーをピックアップし、
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::　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)のシングルコロニーをピックアップし、
::　それぞれ以下の条件で6時間ほど振とう培養を行った
::　それぞれ以下の条件で6時間ほど振とう培養を行った
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::　　　pSB1A2(12-M)→LB(+amp)(2ml)
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::　　　pSB1A2(E0240)→LB(+amp)(2ml)
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::　　　pSB1C3(3-A)→LB(+クロラムフェニコール)(2ml)
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::　　　pSB1C3(J04450)→LB(+cam)(2ml)
::　↓それぞれにアルカリミニプレップを行った
::　↓それぞれにアルカリミニプレップを行った
::　↓次の条件で制限酵素処理を行った
::　↓次の条件で制限酵素処理を行った
::　　　ミリQ　11μl
::　　　ミリQ　11μl
::　　　Hバッファー　2μl
::　　　Hバッファー　2μl
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::　　　DNA(pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A))　5μl
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::　　　DNA(pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450))　5μl
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::　　　制限酵素(EcoRⅠ,PstⅠ)　各1μl
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::　　　制限酵素(''EcoRⅠ'',''PstⅠ'')　各1μl
::　↓37℃で1時間インキュベートを行った
::　↓37℃で1時間インキュベートを行った
::　↓電気泳動を行った
::　↓電気泳動を行った
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:(2)　pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ
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:(2)　pSB3K3(J04450),pSB6A(J04450)のミディプレップ
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::　大量培養しておいたpSB3K3(Low copy vector),pSB6A1(Low copy vector)をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した  
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::　大量培養しておいたpSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した  
::　↓比重計で、それぞれ等量を量った
::　↓比重計で、それぞれ等量を量った
::　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
::　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
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::　↓室温、12,000rpmで10分間遠心した
::　↓室温、12,000rpmで10分間遠心した
::　↓上清を保存し、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
::　↓上清を保存し、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
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::　↓カラムの上にW8を10mL加え、洗浄した(×２)
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::　↓カラムの上にW8を10mL加え、洗浄した(×2)
::　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4を5mL加え、DNAを洗浄した
::　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4を5mL加え、DNAを洗浄した
::　↓E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanolを3.5mL加えた
::　↓E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanolを3.5mL加えた
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::　↓この吸光度を計測した
::　↓この吸光度を計測した
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:(3)　コンピテントセル(DH5α)の調整
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:(3)　コンピテントセルの調整
::　DH5αをLBプレート(抗生物質の入ってない)に播いた
::　DH5αをLBプレート(抗生物質の入ってない)に播いた
::　↓37℃で一晩インキュベートした
::　↓37℃で一晩インキュベートした
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:(4)　DH5α(pSB1A2(12-M),pSB1A3(3-A))のシングルコロニーのピックアップ
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:(4)　pSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のシングルコロニーのピックアップ
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::　プレートにはえたDH5α(pSB1A2(12-M)),DH5α(pSB1A3(3-A))のコロニーを、
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::　プレートにはえたpSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のコロニーを、
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::　それぞれ3つずつピックアップしてアンピシリン入りのLB液体培地で
+
::　それぞれ3つずつピックアップしてLB(+amp)液体培地3mlで6時間程度振とう培養した
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::　1コロニーにつき培地3mlの条件で6時間ほど振とう培養した
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【実験結果】
+
:(5)　pSB3K3,pSB6A2のプレカルチャー
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:(1)　バンドがはっきり見えたので、これらを大量培養する
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::　　pSB3K3(J04450)→LB(+amp)(2ml)
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::　　pSB6A2(J04450)→LB(+can)(2ml)
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::　に入れ、6時間ほど振とう培養した
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【実験結果】
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:(1)　バンドが検出できた
:(2)　吸光度の結果
:(2)　吸光度の結果
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::これよりpsB6A1のプラスミドの濃度は5075ng/μLである
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::これよりpsB6A1のプラスミドの濃度は5075ng/μLであった
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::この結果より、十分な量のプラスミド抽出ができたことを確認した
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::この結果より、十分な量のプラスミド抽出ができたと確認できた
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::これよりpSB3K3　のプラスミドの濃度は666 ng/μLである
::これよりpSB3K3　のプラスミドの濃度は666 ng/μLである
::この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した
::この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した
:(3)　後日、十分な数のコロニーを確認した
:(3)　後日、十分な数のコロニーを確認した
 +
:(4)　培養できていた
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:(5)　6時間後生えていた
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:(4)　培養できていた→カットチェック
+
【実験考察】
 +
:(1)　翌日以降、プラスミド回収のための培養を行う
 +
:(2)　抽出したプラスミドは冷蔵保存しておいてライゲーションに使用する
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:(3)　コンピテントセルの調整に引き続き使用する
 +
:(4)　翌日、プラスミド抽出をして制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する
 +
:(5)　次の培養のための種培養にする

Revision as of 01:19, 27 September 2010

August 17

【時間】

9:00～17:00

【実験担当】

岩城,福山,古道,革島,吉村

【実験目的】

(1)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する　[革島]
(2)　pSB3K3(J04450),pSB6A(J04450)のプラスミド抽出　[革島]
(3)　コンピテントセル(DH5α)の調整　[古道、吉村]
(4)　pSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のシングルコロニーのピックアップ　[福山]
(5)　pSB3K3,pSB6A2のプレカルチャー　[革島]

【実験内容】

(1)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)のシングルコロニーと制限酵素処理、電気泳動
　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)のシングルコロニーをピックアップし、
　それぞれ以下の条件で6時間ほど振とう培養を行った
　　　pSB1A2(E0240)→LB(+amp)(2ml)
　　　pSB1C3(J04450)→LB(+cam)(2ml)
　↓それぞれにアルカリミニプレップを行った
　↓次の条件で制限酵素処理を行った
　　　ミリQ　11μl
　　　Hバッファー　2μl
　　　DNA(pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450))　5μl
　　　制限酵素(EcoRⅠ,PstⅠ)　各1μl
　↓37℃で1時間インキュベートを行った
　↓電気泳動を行った
(2)　pSB3K3(J04450),pSB6A(J04450)のミディプレップ
　大量培養しておいたpSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した
　↓比重計で、それぞれ等量を量った
　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
　↓遠心後、上清を捨てた
　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
　↓N3 4mLを加えた
　↓室温、12,000rpmで10分間遠心した
　↓上清を保存し、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
　↓カラムの上にW8を10mL加え、洗浄した(×2)
　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4を5mL加え、DNAを洗浄した
　↓E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanolを3.5mL加えた
　↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した
　↓遠心後、上清を捨てた
　↓70% ethanolを3mL加えた
　↓15,000rpm、4℃で5分間遠心した　
　↓遠心後、上清を捨てた
　↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥させた
　↓TEを50μL加え、溶け切るまで冷蔵した
　↓この吸光度を計測した
(3)　コンピテントセルの調整
　DH5αをLBプレート(抗生物質の入ってない)に播いた
　↓37℃で一晩インキュベートした
(4)　pSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のシングルコロニーのピックアップ
　プレートにはえたpSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のコロニーを、
　それぞれ3つずつピックアップしてLB(+amp)液体培地3mlで6時間程度振とう培養した
(5)　pSB3K3,pSB6A2のプレカルチャー
　　pSB3K3(J04450)→LB(+amp)(2ml)
　　pSB6A2(J04450)→LB(+can)(2ml)
　に入れ、6時間ほど振とう培養した

【実験結果】

(1)　バンドが検出できた
(2)　吸光度の結果
pSB6A1pSB3K3
1回目1.1320.155
2回目0.9940.138
3回目0.9840.126
4回目0.9900.122
5回目0.9750.125
平均1.0150.1332
これよりpsB6A1のプラスミドの濃度は5075ng/μLであった
この結果より、十分な量のプラスミド抽出ができたと確認できた
これよりpSB3K3　のプラスミドの濃度は666 ng/μLである
この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した
(3)　後日、十分な数のコロニーを確認した
(4)　培養できていた
(5)　6時間後生えていた

【実験考察】

(1)　翌日以降、プラスミド回収のための培養を行う
(2)　抽出したプラスミドは冷蔵保存しておいてライゲーションに使用する
(3)　コンピテントセルの調整に引き続き使用する
(4)　翌日、プラスミド抽出をして制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する
(5)　次の培養のための種培養にする
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