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From 2010.igem.org

August 17

Time

9:00～17:00

Member

岩城,福山,古道,革島,吉村

Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Kawashima,Yoshimura

Purpose

1. The insertion of a target plasmid is confirmed by digestion by restriction enzyme of pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450). [Kawashima]
2. DNA miniprep of pSB3K3(J04450) and pSB6A(J04450).[Kawashima]
3. Preparing chemically competent cells.[Furumuchi・Yoshimura]
4. Pick up a single colony of pSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450) from plate.[Fukuyama]
5. Pre-culture of pSB3K3(J04450) and pSB6A2(J04450).[Kawashima]

(1)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する　[革島]

(2)　pSB3K3(J04450),pSB6A(J04450)のプラスミド抽出　[革島]

(3)　コンピテントセル(DH5α)の調整　[古道、吉村]

(4)　pSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のシングルコロニーのピックアップ　[福山]

(5)　pSB3K3(J04450),pSB6A2(J04450)のプレカルチャー　[革島]

Method

(1)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)のシングルコロニーと制限酵素処理、電気泳動

　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)のシングルコロニーをピックアップし、

　それぞれ以下の条件で6時間ほど振とう培養を行った

　　　pSB1A2(E0240)→LB(+amp)(2ml)

　　　pSB1C3(J04450)→LB(+cam)(2ml)

　↓それぞれにアルカリミニプレップを行った

　↓次の条件で制限酵素処理を行った

　　　ミリQ　11μl

　　　Hバッファー　2μl

　　　DNA(pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450))　5μl

　　　制限酵素(EcoRⅠ,PstⅠ)　各1μl

　↓37℃で1時間インキュベートを行った

　↓電気泳動を行った

(2)　pSB3K3(J04450),pSB6A(J04450)のミディプレップ

　大量培養しておいたpSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した

　↓比重計で、それぞれ等量を量った

　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した

　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした

　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した

　↓N3 4mLを加えた

　↓室温、12,000rpmで10分間遠心した

　↓上清を保存し、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた

　↓カラムの上にW8を10mL加え、洗浄した(×2)

　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4を5mL加え、DNAを洗浄した

　↓E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanolを3.5mL加えた

　↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓70% ethanolを3mL加えた

　↓15,000rpm、4℃で5分間遠心した　

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥させた

　↓TEを50μL加え、溶け切るまで冷蔵した

　↓この吸光度を計測した

(3)　コンピテントセルの調整

　DH5αをLBプレート(抗生物質の入ってない)に播いた

　↓37℃で一晩インキュベートした

(4)　pSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のシングルコロニーのピックアップ

　プレートにはえたpSB1A2(E0240),pSB1A3(J04450)のコロニーを、

　それぞれ3つずつピックアップしてLB(+amp)液体培地3mlで6時間程度振とう培養した

(5)　pSB3K3,pSB6A2のプレカルチャー

　　pSB3K3(J04450)→LB(+kan)(2ml)

　　pSB6A2(J04450)→LB(+amp)(2ml)

　に入れ、6時間ほど振とう培養した

Result

(1)　バンドが検出できた

(2)　吸光度の結果

pSB6A1 pSB3K3 1回目 1.132 0.155 2回目 0.994 0.138 3回目 0.984 0.126 4回目 0.990 0.122 5回目 0.975 0.125 平均 1.015 0.1332

これよりpsB6A1のプラスミドの濃度は5075ng/μLであった この結果より、十分な量のプラスミド抽出ができたと確認できた これよりpSB3K3　のプラスミドの濃度は666 ng/μLである この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

(3)　後日、十分な数のコロニーを確認した

(4)　培養できていた

(5)　6時間後生えていた

Consideration

(1)　翌日以降、プラスミド回収のための培養を行う

(2)　抽出したプラスミドは冷蔵保存しておいてライゲーションに使用する

(3)　コンピテントセルの調整に引き続き使用する

(4)　翌日、プラスミド抽出をして制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する

(5)　次の培養のための種培養にする