Template:KIT-Kyoto-Augsut22

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Revision as of 08:08, 24 September 2010

August 22

【時間】

9:00～

【実験担当】

古道、臼井、中村、足立

【実験名】

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動

(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

【実験目的】

(1)　PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック

(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]の培養

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

【実験内容】

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動

　8月21日(土)にPCRで複製したAcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を

　各4本ずつ計12本電気泳動を行うことによりPCR産物の複製の程度を調べた

　AcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を

　各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した

　↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った

　↓EtBr(10mg/ml)で20分間染色した

　↓泳動結果を写真撮影した

※結果は写真参照

(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー

　プレート培地上のコロニーからpSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]をピックアップし、

　各2本ずつ、3mLの液体LB培地を使用し、37℃で振とう培養した(overnight)

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

　AcrAB,oxyRに関して8月21日の実験結果より

　以下のようにMg4μL、テンプレートDNA1μLの試薬組成でAcrAB,oxyRのプロモーターを大量に複製した

＜PCR試薬組成＞
PrimerF	1.5μL
PrimerR	1.5μL
dNTPs	5μL
KOD-Plus- Buffer	5μL
テンプレートDNA (DH5α,JM109)	1μL
MgSO4	4μL
H2O	31μL
KOD-Plus-	1μL
total	50μL

＜設定＞
Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
94℃	94℃	62.8℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	20sec	2min	保持
	35サイクル

【実験結果】

(1)　8月21日(土)のPCR試薬組成(2)で電気泳動をしたところ、

　　AcrAB(DH5α)

　　AcrAB(JM109)

　　oxyR(DH5α)

　　oxyR(JM109)

それぞれでバンドがはっきりと確認できた

(2)　翌日pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ] は培養が成功していたので、

後日使うまで、冷蔵保存しておいた

(3)　詳しい結果は23日(2)に掲載した

@@ Line 6: / Line 6: @@
 【実験担当】
 :古道、臼井、中村、足立
 【実験名】
 :(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動
 :(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー
 :(3)　AcrAB,oxyRのPCR
 【実験目的】
 :(1)　PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック
@@ Line 25: / Line 25: @@
 ::　各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した
 ::　↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った
-::　↓EtBr染色(10mg/ml)を20分間行った
+::　↓EtBr(10mg/ml)で20分間染色した
 ::　↓泳動結果を写真撮影した
+::※結果は写真参照
 :(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー
 ::　プレート培地上のコロニーからpSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]をピックアップし、
-::　各2本ずつ、3mLの液体LB培地を使用して37℃で振とう培養した(overnight)
+::　各2本ずつ、3mLの液体LB培地を使用し、37℃で振とう培養した(overnight)
 :(3)　AcrAB,oxyRのPCR
-:AcrAB,oxyRに関して、以下の条件で大量に複製した
+::　AcrAB,oxyRに関して8月21日の実験結果より
-:実験(1)で8月21日(土)の試薬組成を試したところ結果が良好であったため、それを用いて実験を行った
+::　以下のようにMg4μL、テンプレートDNA1μLの試薬組成でAcrAB,oxyRのプロモーターを大量に複製した
-:＊()内の番号については、21日のPCR試薬組成表と対応している
-:　　　AcrAB(DH5α)――――(2)
+::<TABLE BORDER="0"><TR>
-:　　　AcrAB(JM109)――――(2)
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
-:　　　oxyR(DH5α)――――(2)
+::<TD>＜PCR試薬組成＞</TD></TR>
-:　　　oxyR(JM109)――――(2)
+::<TR>
+::<TD>PrimerF</TD><TD>1.5μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>PrimerR</TD><TD>1.5μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>dNTPs</TD><TD>5μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>KOD-Plus- Buffer</TD><TD>5μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>テンプレートDNA<BR>(DH5α,JM109)</TD><TD>1μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>MgSO4</TD><TD>4μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>H2O</TD><TD>31μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>KOD-Plus-</TD><TD>1μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>total</TD><TD>50μL</TD></TR>
+::</TABLE></TD>
+::<TD></TD><TD></TD>
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD>＜設定＞</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>Pre Denature</TD><TD>Denature</TD><TD>Annealing</TD><TD>Extention</TD><TD>+Extention</TD><TD></TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>62.8℃</TD><TD>68℃</TD><TD>68℃</TD><TD>4℃</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>20sec</TD><TD>2min</TD><TD>保持</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD></TD><TD COLSPAN="3">35サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR>
+::</TABLE>
+::</TD></TR></TABLE>
-:＜PCRの試薬組成＞
+【実験結果】
-:
+:(1)　8月21日(土)のPCR試薬組成(2)で電気泳動をしたところ、
-:  AcrAB
+::　　AcrAB(DH5α)
-: oxyR
+::　　AcrAB(JM109)
-:
+::　　oxyR(DH5α)
-:PrimerF 1.5μL 1.5μL
+::　　oxyR(JM109)
-:PrimerR 1.5μL 1.5μL
+::それぞれでバンドがはっきりと確認できた
-:dNTPs 5μL 5μL
+:(2)　翌日pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ] は培養が成功していたので、
-:KOD-Plus- Buffer
+::後日使うまで、冷蔵保存しておいた
-: 5μL 5μL
+:(3)　詳しい結果は23日(2)に掲載した
-:テンプレートDNA
-:(DH5α,JM109) 1μL 1μL
-:MgSO4 4μL 4μL
-:H2O 31μL 31μL
-:KOD-Plus- 1μL 1μL
-:
-:total 50μL 50μL
-:
-:
-::＜設定＞
-:Pre　Denature・・・94℃、2min
-:
-:35Cycles↓
-:・Denature・・・・・・・94℃、15sec
-:・Annealing・・・・・・62.8℃、30sec
-:・Extension・・・・・・68℃、20sec
-:
-:+Extension・・・・・・68℃、2min
-:　　　　　　　　　　　　 4℃、∞
-:
-:
-:【実験結果】
-:(1)8月21日(土)の試薬組成
-:　・AcrAB(DH5α)の(2)
-:　・AcrAB(JM109)の(2)
-:　・oxyR(DH5α)の(2)
-:　・oxyR(JM109)の(2)
-:　でバンドがはっきりと確認できた。
-:
-:(2)翌日pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ] は培養が成功していたので、後日使うまで、冷蔵保存しておいた。
-:
-(3)23日(2)に掲載した。