"
Template:KIT-Kyoto-Augsut21
From 2010.igem.org
(Difference between revisions)
(→Augsut 21) |
Matsubara3 (Talk | contribs) (→No title) |
||
| Line 1: | Line 1: | ||
== August 21 == | == August 21 == | ||
| - | === | + | 【時間】 |
| + | :9:00～ | ||
| + | |||
| + | 【実験担当】 | ||
| + | :竹内、革島、足立、吉村 | ||
| + | |||
| + | 【実験名】 | ||
| + | :(1) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動 | ||
| + | :(2) DH５α(R0040),DH５α(I13522)のアルカリミニプレップ | ||
| + | :(3) AcrAB,PoxyのPCR | ||
| + | |||
| + | 【実験目的】 | ||
| + | :(1) DH５αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック | ||
| + | :(2) DH５α(R0040),DH５α(I13522)のプラスミド抽出 | ||
| + | :(3) AcrAB,PoxyのPCR | ||
| + | |||
| + | 【実験内容】 | ||
| + | :(1) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動 | ||
| + | :: 8月20日(金)にアルカリミニプレップによって取り出したプラスミド、 | ||
| + | :: DNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))の確認を電気泳動によって行った | ||
| + | |||
| + | :: pSB6A1(K121013)(左から2~5番目のコーム), | ||
| + | :: pSB6A1(J04450)(左から6~8番目のコーム)を5μLずつ、 | ||
| + | :: それぞれLoading Buffer 1μLを加え六倍希釈にしコームに流した | ||
| + | :: ↓1kbp radder(1番左のコーム)をマーカーとして使用し、100vで25分間電気泳動を行った | ||
| + | :: ↓EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min | ||
| + | :: ↓泳動結果を写真撮影した | ||
| + | |||
| + | :(2) DH５α(R0040),DH５α(I13522)のプラスミド抽出 | ||
| + | :: 8月20日(金)に培養したDH５α(R0040),DH５α(I13522)1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した | ||
| + | :: ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた | ||
| + | :: ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex) | ||
| + | :: ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可) | ||
| + | :: ↓5分間、氷上で放置した | ||
| + | :: ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex) | ||
| + | :: ↓5分間、氷上で放置した | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した | ||
| + | :: ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した | ||
| + | :: ↓等量(400μL)のイソプロピルアルコールを加えた | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した | ||
| + | :: ↓70％EtOHを1mL加えた(vortex) | ||
| + | :: ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心 | ||
| + | :: ↓30秒間、遠心乾燥を行った | ||
| + | :: ↓RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAにした | ||
| + | |||
| + | :: カットチェック(電気泳動) | ||
| + | ::<TABLE BORDER="0"><TR> | ||
| + | ::<TD VALIGN="top">右の表に従い試薬を調整し、これを37℃で1時間インキュベートした<BR>↓Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した<BR> (マーカーは1kbp radderを使用した)<BR>↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した<BR>↓泳動結果を写真で撮影した</TD> | ||
| + | ::<TD></TD><TD></TD> | ||
| + | ::<TD><TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | ::<TD>＜試薬組成＞</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>''EcoRⅠ''</TD><TD>1μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>''PstⅠ''</TD><TD>1μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>プラスミドDNA<BR>(DH５α(R0040),DH５α(I13522))</TD><TD>5μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>11μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>H Buffer</TD><TD>2μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>計</TD><TD>20μL</TD></TR> | ||
| + | ::</TABLE> | ||
| + | ::</TD></TR></TABLE> | ||
| + | |||
| + | :(3) AcrAB,PoxyのPCR | ||
| + | :: 以下の試薬組成、プログラムに従ってPCRを行った | ||
| + | ::<TABLE BORDER="0"><TR> | ||
| + | ::<TD><TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | ::<TD>試薬組成</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD></TD><TD>(1)</TD><TD>(2)</TD><TD>(3)</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>テンプレートDNA(DH5α)</TD><TD>1μL</TD><TD>1μL</TD><TD>2μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>MgSO4</TD><TD>2μL</TD><TD>4μL</TD><TD>3μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>プライマーF</TD><TD>1.5μL</TD><TD>1.5μL</TD><TD>1.5μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>プライマーR</TD><TD>1.5μL</TD><TD>1.5μL</TD><TD>1.5μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>KOD-Plusｰ</TD><TD>1μL</TD><TD>1μL</TD><TD>1μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>H2O</TD><TD>33μL</TD><TD>31μL</TD><TD>32μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>dNTPs</TD><TD>5μL</TD><TD>5μL</TD><TD>5μL</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>total</TD><TD>50μL</TD><TD>50μL</TD><TD>50μL</TD></TR> | ||
| + | ::</TABLE></TD> | ||
| + | ::<TD></TD><TD></TD> | ||
| + | ::<TD><TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | ::<TD>Pre Denature</TD><TD>Denature</TD><TD>Annealing</TD><TD>Extention</TD><TD></TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>62.8℃</TD><TD>68℃</TD><TD>4℃</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>20sec</TD><TD>保持</TD></TR> | ||
| + | ::<TR> | ||
| + | ::<TD></TD><TD COLSPAN="3">35サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR> | ||
| + | ::</TABLE> | ||
| + | ::</TD></TR></TABLE> | ||
| + | |||
| + | :: 結果は写真参照 | ||
| + | |||
| + | 【実験結果】 | ||
| + | :(1) 写真の結果 | ||
| + | ::pSB6A1(K121013)のバンドは4つとも見えなかった | ||
| + | :: →アルカリミニプレップのやり直し | ||
| + | ::pSB6A1(J04450)の3つのバンドは、3つともバンドが見えた(ただし一番左のみ少し) | ||
| + | ::pSB6A1(J04450)に関しては十分量DH5αにベクターが組み込まれたとみなし実験でこれを使用した | ||
| + | :(2) DH５α(R0040),DH５α(I13522)それぞれ3種類ずつアプライしたのだが、 | ||
| + | ::全てバンドがはっきりと見えたため、プラスミド挿入が成功していることが確認された | ||
| + | :(3) 目的の遺伝子は精製できた | ||
Revision as of 03:23, 20 September 2010
August 21
【時間】
- 9:00～
【実験担当】
- 竹内、革島、足立、吉村
【実験名】
- (1) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動
- (2) DH５α(R0040),DH５α(I13522)のアルカリミニプレップ
- (3) AcrAB,PoxyのPCR
【実験目的】
- (1) DH５αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック
- (2) DH５α(R0040),DH５α(I13522)のプラスミド抽出
- (3) AcrAB,PoxyのPCR
【実験内容】
- (1) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動
- 8月20日(金)にアルカリミニプレップによって取り出したプラスミド、
- DNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))の確認を電気泳動によって行った
- pSB6A1(K121013)(左から2~5番目のコーム),
- pSB6A1(J04450)(左から6~8番目のコーム)を5μLずつ、
- それぞれLoading Buffer 1μLを加え六倍希釈にしコームに流した
- ↓1kbp radder(1番左のコーム)をマーカーとして使用し、100vで25分間電気泳動を行った
- ↓EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min
- ↓泳動結果を写真撮影した
- (2) DH５α(R0040),DH５α(I13522)のプラスミド抽出
- 8月20日(金)に培養したDH５α(R0040),DH５α(I13522)1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した
- ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
- ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
- ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
- ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
- ↓5分間、氷上で放置した
- ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
- ↓5分間、氷上で放置した
- ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
- ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
- ↓等量(400μL)のイソプロピルアルコールを加えた
- ↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
- ↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)
- ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心
- ↓30秒間、遠心乾燥を行った
- ↓RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAにした
- カットチェック(電気泳動)
右の表に従い試薬を調整し、これを37℃で1時間インキュベートした
↓Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
(マーカーは1kbp radderを使用した)
↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
↓泳動結果を写真で撮影した＜試薬組成＞ EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL プラスミドDNA
(DH５α(R0040),DH５α(I13522))5μL H2O 11μL H Buffer 2μL 計 20μL
- (3) AcrAB,PoxyのPCR
- 以下の試薬組成、プログラムに従ってPCRを行った
試薬組成 (1) (2) (3) テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL 2μL MgSO4 2μL 4μL 3μL プライマーF 1.5μL 1.5μL 1.5μL プライマーR 1.5μL 1.5μL 1.5μL KOD-Plusｰ 1μL 1μL 1μL H2O 33μL 31μL 32μL dNTPs 5μL 5μL 5μL total 50μL 50μL 50μL Pre Denature Denature Annealing Extention 94℃ 94℃ 62.8℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 20sec 保持 35サイクル
- 結果は写真参照
【実験結果】
- (1) 写真の結果
- pSB6A1(K121013)のバンドは4つとも見えなかった
- →アルカリミニプレップのやり直し
- pSB6A1(J04450)の3つのバンドは、3つともバンドが見えた(ただし一番左のみ少し)
- pSB6A1(J04450)に関しては十分量DH5αにベクターが組み込まれたとみなし実験でこれを使用した
- (2) DH５α(R0040),DH５α(I13522)それぞれ3種類ずつアプライしたのだが、
- 全てバンドがはっきりと見えたため、プラスミド挿入が成功していることが確認された
- (3) 目的の遺伝子は精製できた
