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Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August10
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==PCR反応液の調整== | ==PCR反応液の調整== | ||
今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した． | 今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した． | ||
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* 反応液49 uLを４本のPCRチューブに分注し，Templateを1 uLずつ加えた | * 反応液49 uLを４本のPCRチューブに分注し，Templateを1 uLずつ加えた | ||
* それぞれのPCRチューブとTemplate，lengthは | * それぞれのPCRチューブとTemplate，lengthは | ||
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Revision as of 03:55, 19 September 2010
since 13 Jul 2010
since 1 Aug 2010
シングルコロニーアイソレーション
コロニーを確認したところ，3-1Eにはコロニーが見られなかった
ほかのプレートもコロニー数が少なかったため，手順に不完全なところがあったのかもしれない
- 実験中に沈殿が見られたため
- コンピテントセルの溶解が不十分だった？
- 混ぜ方が不十分だった？
- ２回目の実験で，若干急いだ感じだったので，吸着などが不十分だった？
3-1E以外を新しい培地に移した
PCR反応液の調整
今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した．
| Autoclaved DW | 165 uL |
| 10x PCR buffer | 25 uL |
| 2 mM dNTPs | 25 uL |
| 25 mM MgSO4 | 15 uL |
| EX-F primer | 5 uL |
| PS-R primer | 5 uL |
| KOD plus Neo | 5 uL |
| Total | 245 uL |
- 反応液49 uLを４本のPCRチューブに分注し，Templateを1 uLずつ加えた
- それぞれのPCRチューブとTemplate，lengthは
| 1 | 2-24G（sender） | 847 bp |
| 2 | 1-2M（RBS） | 61 bp |
| 3 | 1-23L（terminator） | 178 bp |
| 4 | 3-1E（heat sensor） | 984 bp |
- DNA lengthはパーツ長＋プライマー(49 bp)
- 3-1EはTransformationがうまくいかなかったため
PCR program
| Predenature | 94℃ 2 min |
| Denature | 98℃ 10 sec |
| Extension | 68℃ 30 sec |
- 30 cycle
- 30 sec/kbpなので１cycle30秒で行った
電気泳動
- 増幅したDNAを5 uLとって6xサンプルバッファー1 uLを加えた
- マーカーはpUC119/Hinf1を使用
- エチブロは20 uL使用
