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Template:KIT-Kyoto-Augsut27
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| - | :: | + | :: ↓遠心1分(20℃、14500rpm)して集菌し、エッペン2本分にした |
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:: ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした | :: ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした | ||
:: ↓SolutionⅡを250μl加えた | :: ↓SolutionⅡを250μl加えた | ||
:: ↓SolutionⅢを350μl加えた | :: ↓SolutionⅢを350μl加えた | ||
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:: ↓上清をカラムに入れた | :: ↓上清をカラムに入れた | ||
| - | :: | + | :: ↓遠心30秒(20℃、14500rpm) |
:: ↓抽出液を捨てた | :: ↓抽出液を捨てた | ||
:: ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた | :: ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた | ||
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:: ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた | :: ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた | ||
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:: ↓滅菌水をカラムに入れた | :: ↓滅菌水をカラムに入れた | ||
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:: ↓溶出液を回収 | :: ↓溶出液を回収 | ||
:: ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた | :: ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた | ||
| - | :: | + | :: ↓遠心10分(4℃、14000rpm) |
| - | :: | + | :: ↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた |
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:: ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥 | :: ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥 | ||
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| - | :: | + | ::MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液(0.44mg/mL)を1滴加えた |
'''Results''' | '''Results''' | ||
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::これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる | ::これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる | ||
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| - | :( | + | :(1) 次回からは100倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき |
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Latest revision as of 11:26, 25 October 2010
August 27
Time
- 9:00～
Member
- 福山,竹内,臼井
- Fukuyama,Takeuchi,Usui
Purpose
- DNA miniprep of psB6A1(K121013).[Takeuchi]
- Making of EtBr.[Takeuchi]
- (1) psB6A1(K121013)のミニプレ [竹内]
- (2) エチジウムブロマイドの作成 [竹内]
Method
- (1) psB6A1(K121013)のミニプレ
- psB6A1(K121013)24mL分を分注した
- ↓遠心1分(20℃、14500rpm)して集菌し、エッペン2本分にした
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14500rpm)
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分(20℃、14500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
- ↓溶出液を回収
- ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
- ↓遠心10分(4℃、14000rpm)
- ↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
- ↓遠心5分(4℃、14000rpm)
- ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
- ↓MilliQを30μl加えた
- ↓二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した
- Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
- (マーカーは1kbp radderを使用した)
- ↓100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
- ↓泳動結果を写真で撮影した
- (2) エチジウムブロマイドの作成
- MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液(0.44mg/mL)を1滴加えた
Results
- (1) 十分に濃いバンドが確認できた
- これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる
- (2) 1滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに3滴付加したところ十分に使用できるようになった
Consideration
- (1) 次回からは100倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき
- (2) これより40mL分を作る時は少なくとも4滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる
