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August 23

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Time

9:00～21:00

Member

岩城,竹内,中村,臼井,吉村

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Yoshimura

Title

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる　[吉村]　

(2)　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック　[中村、臼井]

(3)　dps,acrABのDNA濃度測定　[中村、臼井]

Purpose

The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
PCR of dps,AcrAB,trxC,and OxyR.And Comfirm those by agarose gel electrophoresis.[Nakamura,Usui]
Measurement of density of DNA of dps and acrAB.[Nakamura,Usui]

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

(2)　活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック

(3)　dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

　30％ H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくった

　↓4M H2O2(250μl)とミリQ(750μl)で1MのH2O2をつくった

　↓以下10倍希釈していき、1nM H2O2まで作成した

　次にDH5αのシングルコロニーをピックアップした

　↓LB(-amp)2mlでプレカルチャーを行った

　↓(37℃でインキュベート、overnight)

(2)　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック

　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCRを以下の組成、設定で行った

＜組成＞
(dps,grxA,trxC)		(oxyR)
PrimerR	1.5μL	PrimerR	3μL
PrimerF	1.5μL	PrimerF	3μL
dNTP	5μL	dNTP	20μL
Buffer	5μL	Buffer（KOD－FX）	50μL
DNA（DH5α）	0.5μL	DNA（DH5α）	2μL
MgSO₄	4μL	MilliQ	20μL
MilliQ	31.5μL	KOD－FX	2μL
KOD－Plus	1μL
全量	50μL	全量	100μL

＜PCRの設定＞
	(dps,grxA ,trxC)	(oxyR)
1．Pre　Penature	94℃―2min	94℃―2min
2．Denature	94℃―15sec	94℃―10sec
3．Annealing	59.7℃―30sec	52℃―30sec
4．Extension	68℃―30sec	68℃―45sec
5．+Extension	68℃ー2min	68℃ー2min

またPCR後、それぞれ電気泳動によるチェックを以下の条件で行った
　1回目　100V、20min　EtBr　20min
　2回目　135V、15min　EtBr　10min

(3)　dps,acrABのDNA濃度測定

　吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった

Results

(1)　実験結果は25日のノートに記載した

(2)　1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった

2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった

＊詳細は写真参照

(3)　吸光度の測定結果

以下の吸光度の結果から、PCRが十分と判断された

吸光度	dps	acrAB
1回目	0.340	0.565
2回目	0.329	0.555
3回目	0.314	0.556
4回目	0.309	0.556
5回目	0.312	0.551
平均値	0.321	0.557

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 == August 23 ==
+<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
-【時間】
+'''Time'''
 :9:00～21:00
-【実験担当】
+'''Member'''
 :岩城,竹内,中村,臼井,吉村
+:Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Yoshimura
-【実験名】
+'''Title'''
+:(1)　大腸菌の生存曲線を調べる　[吉村]
+:(2)　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック　[中村、臼井]
+:(3)　dps,acrABのDNA濃度測定　[中村、臼井]
+'''Purpose'''
+:# The survivorship curve of E. coli　is examined. [Yoshimura]
+:# PCR of dps,AcrAB,trxC,and OxyR.And Comfirm those by agarose gel electrophoresis.[Nakamura,Usui]
+:# Measurement of density of DNA of dps and acrAB.[Nakamura,Usui]
 :(1)　大腸菌の生存曲線を調べる
-:(2)　dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック
-:(3)　dps,acrABのDNA濃度測定
-【実験目的】
-:(1)　大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)
 :(2)　活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック
 :(3)　dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。
-【実験内容】
+'''Method'''
 :(1)　大腸菌の生存曲線を調べる
 ::　30％  H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくった
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 <TD>DNA（DH5α）</TD><TD>0.5μL</TD><TD></TD><TD>DNA（DH5α）</TD><TD>2μL</TD></TR>
 <TR>
-<TD>MgSO4</TD><TD>4μL</TD><TD></TD><TD>MilliQ</TD><TD>20μL</TD></TR>
+<TD>MgSO<SUB>4</SUB></TD><TD>4μL</TD><TD></TD><TD>MilliQ</TD><TD>20μL</TD></TR>
 <TR>
 <TD>MilliQ</TD><TD>31.5μL</TD><TD></TD><TD>KOD－FX</TD><TD>2μL</TD></TR>
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 ::　吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった
-【実験結果】
+'''Results'''
 :(1)　実験結果は25日のノートに記載した
 :(2)　1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった
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 ::＊詳細は写真参照
 :(3)　吸光度の測定結果
-::以下の吸光度の結果から、PCRに十分と判断された
+::以下の吸光度の結果から、PCRが十分と判断された
 :<TABLE BORDER="1"><TR>
 :<TD>吸光度</TD><TD>dps</TD><TD>acrAB</TD></TR>