Template:KIT-Kyoto-Augsut27

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:福山,竹内,臼井
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:Fukuyama,Takeuchi,Usui
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【実験担当】福山,竹内,臼井
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'''Purpose'''
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:# DNA miniprep of psB6A1(K121013).[Takeuchi]
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【実験目的】
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:# Making of EtBr.[Takeuchi]
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(1)K121013(on psB6A1)のミニプレ
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:(1)　psB6A1(K121013)のミニプレ　[竹内]
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(2)エチジウムブロマイドの作成
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:(2)　エチジウムブロマイドの作成　[竹内]
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【実験内容】
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(1) 
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K121013(on psB6A1)24mL分を分注した。
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:(1)　psB6A1(K121013)のミニプレ
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::　psB6A1(K121013)24mL分を分注した
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::　↓遠心1分(20℃、14500rpm)して集菌し、エッペン2本分にした
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::　↓上清を捨てた
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::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
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::　↓SolutionⅡを250μl加えた
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::　↓SolutionⅢを350μl加えた
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::　↓遠心5分(20℃、14500rpm)
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::　↓上清をカラムに入れた
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::　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
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::　↓抽出液を捨てた
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::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
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::　↓遠心1分(20℃、14500rpm)
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::　↓抽出液を捨てた
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::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
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::　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
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::　↓抽出液を捨てた
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::　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
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::　↓抽出液を捨てた
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::　↓滅菌水をカラムに入れた
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::　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
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::　↓溶出液を回収
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::　↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
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::　↓遠心10分(4℃、14000rpm)
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::　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
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::　↓遠心5分(4℃、14000rpm)
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::　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
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::　↓MilliQを30μl加えた
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::　↓二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した
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遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌し、エッペン２本分にした
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::　　Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した
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::　　(マーカーは1kbp radderを使用した)
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::　　↓100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
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::　　↓泳動結果を写真で撮影した
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:(2)　エチジウムブロマイドの作成
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::MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液(0.44mg/mL)を1滴加えた
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酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、
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それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
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遠心１０分（4℃、14000rpm）
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上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。
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遠心5分（4℃、14000rpm）
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上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
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MilliQを30μl加えた
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二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した。
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Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した
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(マーカーは1kbp radderを使用した)
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　　　　　　　　↓
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100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
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　　　　　　　　↓
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泳動結果を写真で撮影した
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（２）
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MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液（0.44mg/mL）を１滴加えた。
+
   
   
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【実験結果】
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'''Results'''
-
(１)十分に濃いバンドが確認できた
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:(1)　十分に濃いバンドが確認できた
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これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる
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::これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる
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次回からは１００倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき
+
:(2)　1滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに3滴付加したところ十分に使用できるようになった
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(２)
+
'''Consideration'''
-
１滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに３滴付加したところ十分に使用できるようになった
+
:(1)　次回からは100倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき
-
これより40mL分を作る時は少なくとも４滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる
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:(2)　これより40mL分を作る時は少なくとも4滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる

Latest revision as of 11:26, 25 October 2010

August 27

>>top

Time

9:00～

Member

福山,竹内,臼井
Fukuyama,Takeuchi,Usui

Purpose

  1. DNA miniprep of psB6A1(K121013).[Takeuchi]
  2. Making of EtBr.[Takeuchi]
(1)　psB6A1(K121013)のミニプレ　[竹内]
(2)　エチジウムブロマイドの作成　[竹内]

Method

(1)　psB6A1(K121013)のミニプレ
　psB6A1(K121013)24mL分を分注した
　↓遠心1分(20℃、14500rpm)して集菌し、エッペン2本分にした
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓遠心5分(20℃、14500rpm)
　↓上清をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓遠心1分(20℃、14500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
　↓溶出液を回収
　↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
　↓遠心10分(4℃、14000rpm)
　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
　↓遠心5分(4℃、14000rpm)
　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
　↓MilliQを30μl加えた
　↓二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した
　　Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した
　　(マーカーは1kbp radderを使用した)
　　↓100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
　　↓泳動結果を写真で撮影した
(2)　エチジウムブロマイドの作成
MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液(0.44mg/mL)を1滴加えた

Results

(1)　十分に濃いバンドが確認できた
これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる
(2)　1滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに3滴付加したところ十分に使用できるようになった

Consideration

(1)　次回からは100倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき
(2)　これより40mL分を作る時は少なくとも4滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる
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