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Template:KIT-Kyoto-Augsut22
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| + | ::後日使うまで、冷蔵保存しておいた | ||
| + | :(3) 詳しい結果は23日(2)に掲載した | ||
Latest revision as of 11:03, 25 October 2010
August 22
Time
- 9:00～
Member
- 古道、臼井、中村、足立
- Furumichi,Usui,Nakamura,Adachi
Title
- (1) PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動 [足立、臼井]
- (2) pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のプレカルチャー [臼井]
- (3) AcrAB,oxyRのPCR [臼井]
Purpose
- Agarose gel electrophoresis of AcrAB and OxyR.[Adachi,Usui]
- Pre-culture of pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950).[Usui]
- PCR of AcrAB and OxyR.[Usui]
- (1) PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック
- (2) pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)の培養
- (3) AcrAB,oxyRのPCR
Method
- (1) PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動
- 8月21日(土)にPCRで複製したAcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を
- 各4本ずつ計12本電気泳動を行うことによりPCR産物の複製の程度を調べた
- AcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を
- 各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した
- ↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った
- ↓EtBr(10mg/ml)で20分間染色した
- ↓泳動結果を写真撮影した
- ※結果は写真参照
- (2) pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー
- プレート培地上からpSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のシングルコロニーをピックアップした
- ↓各2本ずつ、3mLの液体LB培地(+amp)を使用し、37℃で振とう培養した(overnight)
- (3) AcrAB,oxyRのPCR
- AcrAB,oxyRに関して8月21日の実験結果より
- 以下のようにMg4μL、テンプレートDNA1μLの試薬組成でAcrAB,oxyRのプロモーターを大量に複製した
＜PCR試薬組成＞ PrimerF 1.5μL PrimerR 1.5μL dNTPs 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL テンプレートDNA
(DH5α,JM109)1μL MgSO4 4μL H2O 31μL KOD-Plus- 1μL total 50μL ＜設定＞ Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 94℃ 94℃ 62.8℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 20sec 2min 保持 35サイクル
Results
- (1) 8月21日(土)のPCR試薬組成(2)で電気泳動をしたところ、
- AcrAB(DH5α)
- AcrAB(JM109)
- oxyR(DH5α)
- oxyR(JM109)
- それぞれでバンドが確認できなかった
- (2) 翌日pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)は培養が成功していたので、
- 後日使うまで、冷蔵保存しておいた
- (3) 詳しい結果は23日(2)に掲載した
