Template:KIT-Kyoto-Augsut22

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August 22

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Time

9:00～

Member

古道、臼井、中村、足立

Furumichi,Usui,Nakamura,Adachi

Title

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動　[足立、臼井]

(2)　pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のプレカルチャー　[臼井]

(3)　AcrAB,oxyRのPCR　[臼井]

Purpose

Agarose gel electrophoresis of AcrAB and OxyR.[Adachi,Usui]
Pre-culture of pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950).[Usui]
PCR of AcrAB and OxyR.[Usui]

(1)　PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック

(2)　pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)の培養

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

Method

(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動

　8月21日(土)にPCRで複製したAcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を

　各4本ずつ計12本電気泳動を行うことによりPCR産物の複製の程度を調べた

　AcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を

　各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した

　↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った

　↓EtBr(10mg/ml)で20分間染色した

　↓泳動結果を写真撮影した

※結果は写真参照

(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー

　プレート培地上からpSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のシングルコロニーをピックアップした

　↓各2本ずつ、3mLの液体LB培地(+amp)を使用し、37℃で振とう培養した(overnight)

(3)　AcrAB,oxyRのPCR

　AcrAB,oxyRに関して8月21日の実験結果より

　以下のようにMg4μL、テンプレートDNA1μLの試薬組成でAcrAB,oxyRのプロモーターを大量に複製した

＜PCR試薬組成＞
PrimerF	1.5μL
PrimerR	1.5μL
dNTPs	5μL
KOD-Plus- Buffer	5μL
テンプレートDNA (DH5α,JM109)	1μL
MgSO₄	4μL
H₂O	31μL
KOD-Plus-	1μL
total	50μL

＜設定＞
Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
94℃	94℃	62.8℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	20sec	2min	保持
	35サイクル

Results

(1)　8月21日(土)のPCR試薬組成(2)で電気泳動をしたところ、

　　AcrAB(DH5α)

　　AcrAB(JM109)

　　oxyR(DH5α)

　　oxyR(JM109)

それぞれでバンドが確認できなかった

(2)　翌日pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)は培養が成功していたので、

後日使うまで、冷蔵保存しておいた

(3)　詳しい結果は23日(2)に掲載した

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-== Augsut 22 ==
+== August 22 ==
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+:古道、臼井、中村、足立
+:Furumichi,Usui,Nakamura,Adachi
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+:(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動　[足立、臼井]
+:(2)　pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のプレカルチャー　[臼井]
+:(3)　AcrAB,oxyRのPCR　[臼井]
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+:# Agarose gel electrophoresis of AcrAB and OxyR.[Adachi,Usui]
+:# Pre-culture of pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950).[Usui]
+:# PCR of AcrAB and OxyR.[Usui]
+:(1)　PCRによってAcrAB,oxyRの大量複製に成功しているかのチェック
+:(2)　pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)の培養
+:(3)　AcrAB,oxyRのPCR
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+:(1)　PCRで複製したAcrAB,oxyRの電気泳動
+::　8月21日(土)にPCRで複製したAcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を
+::　各4本ずつ計12本電気泳動を行うことによりPCR産物の複製の程度を調べた
+::　AcrAB(DH5α)AcrAB(JM109),oxyR(DH5α),oxyR(JM109)を
+::　各サンプルそれぞれ15μLずつにLoading Buffer 1μLを加えコームに流した
+::　↓1kbp radderをマーカーとして使用し100vで20分間電気泳動を行った
+::　↓EtBr(10mg/ml)で20分間染色した
+::　↓泳動結果を写真撮影した
+::※結果は写真参照
+:(2)　pSB4A5(K193602)[MelA],pSB1AK3(I732950)[lacZ]のプレカルチャー
+::　プレート培地上からpSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732950)のシングルコロニーをピックアップした
+::　↓各2本ずつ、3mLの液体LB培地(+amp)を使用し、37℃で振とう培養した(overnight)
+:(3)　AcrAB,oxyRのPCR
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+::　　oxyR(DH5α)
+::　　oxyR(JM109)
+::それぞれでバンドが確認できなかった
+:(2)　翌日pSB4A5(K193602),pSB1AK3(I732019,I732950)は培養が成功していたので、
+::後日使うまで、冷蔵保存しておいた
+:(3)　詳しい結果は23日(2)に掲載した