Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August10

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(→PCR反応液の調整)
(→PCR program)
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==PCR program==
==PCR program==
-
{| border="1"  style="margin-left: 20px;"
+
{|style="margin-left: 20px;" class="protocol"
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| Predenature
| Predenature
| 94℃ 2 min
| 94℃ 2 min
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| Denature
+
|style="border-top:1px solid #996;"| Denature
-
| 98℃ 10 sec
+
|style="border-top:1px solid #996;"| 98℃ 10 sec
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|-
| Extension
| Extension
| 68℃ 30 sec
| 68℃ 30 sec
 +
|-
 +
|style="border-top:1px solid #996;"| Hold
 +
|style="border-top:1px solid #996;"| 4℃
|}
|}
* 30 cycle
* 30 cycle

Revision as of 04:07, 19 September 2010

Notebook

シングルコロニーアイソレーション

コロニーを確認したところ，3-1Eにはコロニーが見られなかった
ほかのプレートもコロニー数が少なかったため，手順に不完全なところがあったのかもしれない

  • 実験中に沈殿が見られたため
    • コンピテントセルの溶解が不十分だった？
    • 混ぜ方が不十分だった？
  • ２回目の実験で，若干急いだ感じだったので，吸着などが不十分だった？

3-1E以外を新しい培地に移した

PCR反応液の調整

今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した．

Autoclaved DW 165 uL
10x PCR buffer 25 uL
2 mM dNTPs 25 uL
25 mM MgSO4 15 uL
EX-F primer 5 uL
PS-R primer 5 uL
KOD plus Neo 5 uL
Total 245 uL
  • 反応液49 uLを４本のPCRチューブに分注し，Templateを1 uLずつ加えた
  • それぞれのPCRチューブとTemplate，lengthは
1 2-24G（sender） 847 bp
2 1-2M（RBS） 61 bp
3 1-23L（terminator） 178 bp
4 3-1E（heat sensor） 984 bp
  • DNA lengthはパーツ長＋プライマー(49 bp)
  • 3-1EはTransformationがうまくいかなかったため

PCR program

Predenature 94℃ 2 min
Denature 98℃ 10 sec
Extension 68℃ 30 sec
Hold 4℃
  • 30 cycle
  • 30 sec/kbpなので１cycle30秒で行った

電気泳動

  • 増幅したDNAを5 uLとって6xサンプルバッファー1 uLを加えた
  • マーカーはpUC119/Hinf1を使用
  • エチブロは20 uL使用
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