Team:Freiburg Bioware/NoteBook/Meetings

iGEM – Meeting 29.1.2010

Besprochene Themen:

Vorstellung:

• Retrovirale Gentherapie
• Virus-like particles
• Adeno-assoziierte Viren/Herpes -simplex-Viren; HSV/AAV Hybridvektor
• Adenovirale Gentherapie
  

Diskussion:

• Immunogenität
• GMP/GLP
• Was wird verpackt im Kapsid? (mi)RNA? Transkriptionsfaktoren? Pharmazeutika?
• Tropismus

iGEM – Meeting 5.2.2010

1 Probleme bei der Literatur-Recherche zum Thema Virus Like Particles, zukünftig werden Paper, die nicht frei erhältlich sind über direkt-Link an Christian geschickt.

2 Eine neue Anwesenheits Liste wurde verschickt, da 3 neue Interessenten anwesend waren

3 In Zukunft sollte zu jedem durchgelesenem Paper eine Zusammenfassung geschrieben werden was eine erhebliche Arbeitserleichterung darstellt.

4 Es wurde ein wenig über die Polioma-Virus-VLPs gefunden. VP1 besitzen Siacylsäure-Derivate an Proteinhülle welche eine effiziente DNA-Bindung bewerkstelligen. Es wäre möglich mittels Insekten-Zellen derartige Proteine zu produzieren.

5 Problem der Sicherheitsbestimmungen wurden aufgeworfen. Alles muss mit Tübingen ausgesprochen.

6 Möglichkeit des Biotin-Tags um effiziente DNA Aufnahme zu gewährleisten.

7 Straßburger Team kommt demnächst nach Freiburg

8 Volker präsentierte seine Idee und gab ein Handout herum, Idee wird weiterverfolgt

9 Wiki wurde erklärt

10 Vor jeden Dateinamen in Zukunft Freiburg10 schreiben

11 Nächste Themen sind Viren-Vektoren sowie Pathogenität

iGEM – Meeting 12.2.2010

Es werden Fotos von den einzelnen Mitgliedern angefertigt.

Es wird von Bea auf das [http://2009.iGEM.org/Team:Tsinghua/ELSI Projekt] der Universität Tsinghua verwiesen, die schon mit Virionen gearbeitet haben. Kristian merkt an, dass man möglicherweise auf ein eukaryotisches System ausweicht, aber vielleicht die Möglichkeit besteht, Biobricks der Gruppe zu integrieren.

Präsentation: Amor, (Postdoc) präsentiert Generelles über virale Systeme.

Datei: *** Bitte noch einfügen***

Ziel von viralen Systemen: Applikation von Genen in den Zielorganismus Es gibt zwei Arten dies zu tun, über die ex vivo- Methode außerhalb des Körpers oder über die in vivo-Methode im Körper Virale Systeme sind die etabliertesten Vektoren für diesen Zweck. Viren: Hohe Spezifität in der Evolution erlangt Effiziente Transfektion Möglichkeit neue Viren zu synthetisieren Verschiedene Viren für verschiedene Anwendungen Integration in das Genom ist möglicherweise wichtig (Gentherapie) Virengröße ist entscheidend Vorstellung der Vor und Nachteile der einzelnen Viralen Systeme (siehe Präsentation) Lentiviren und RNA Viren sind in entscheidenden Kriterien (Maximale Kapazität, Integrationsfähigkeit und Immunogenität) vergleichbar. Adenoviren hingegen Integrieren sich nicht in das Genom, sind aber stark immunogen. In Viralen Systemen wurden ein Großteil der virealen Gene entfernt, durch Inserts ersetzt und mit ]StufferDNA“ gefüllt. Wichtige Kriterien bei der Wahl des Virus: Transformationsfähigkeit Targeting Permanente oder temporäre Insertion in das Genom

Präsentation : Volker über ein BIOS für den VLP

Datei: http://www.molbiotech.uni-freiburg.de/iGEM/wiki2010/images/a/aa/FreiGEM10_DNA_Vaccination_-_BIOS_for_the_VLP.pdf PDF

Präsentation: Christian über Immunogenität

Datei: *** bitte noch hochladen***

Es wird über Liposomenverpackung von DNA diskutiert, die auch eine Möglichkeit der DNA-Übertragung ermöglicht.

Es wird ansatzweise besprochen, in welche Richtung die Themensuche gehen soll, ob eine spezifischer Therapieansatz verfolgt werden soll oder eher ein universelles Tool in Angriff genommen wird. Es kommt zu keiner genaueren Festlegung

Es wird von Hanna vorgeschlagen, ]einfach“ eine Tumorzelle zu targetten und diese dann mit einer DNA zu transfektieren. Darauf hin kommt es zu einer kurzen Diskussion über den Vorschlag.

Kristian merkt an, dass er es möglich wäre, ein bestehendes kommerzielles System zu den eigenen Bedürfnissen umzuwandeln.

Es wird vorgeschlagen, kompetente Experten von interessanten Fachgebieten für einen Vortrag einladen.

Es wird über den Termin des nächsten Meetings abgestimmt. Ergebnis: nächster Freitag 17 h ct.

Es wird vereinbart, dass jeder Teilnehmer ein Thema vorstellt, das zum aktuellen Diskussionsstand innerhalb der Gruppe passt und in fünf Minuten abgehandelt sein soll. Denkbar wären es, folgende Dinge vorzustellen: Publikation aus diesem Gebiet, vergangene iGEM-Porjekte, interessante Biobricks oder relevante Forschungsgruppen aus Freiburg.

Es werden von Kristian die RFC-Standards vorgestellt. Der wichtigste aktuelle Standard ist derzeit der RFC 10. Diese können auf der iGEM-Seite eingesehen werden. Es wurde auch expemplarisch der RFC 25 aus FreiGEM09 vorgestellt.

Kristian schlägt vor, dass sich jeder auf der iGEM-Seite mit der iGEM Philosophie und dem Vokabular vertraut machen sollte.

iGEM - Meeting vom 26.02.2010

Einführung (Kristian)

• Expasy → Viral Zone (Link auf Wiki unter Literatur) gut für schnelle Übersicht über Virengenom, -organisation und -struktur
  
• Computer im Labor im 4.OG laufen alle auf einem Server mit iGEM username und Passwort einloggen möglich,

am besten Computer in Küche/Seminarraum nutzen

Vorstellung von Publikationen
Alle Präsentationen und Handouts werden von den Vortragenden (und damit auch Ansprechpartner bei Fragen) ins Wiki gestellt

1. 1 Adenovirale und HSV/AAV Vektoren (Ansprechpartnerin: Anna)
   

Fazit/Ideen: Spezifische Promotoren einbauen als Sicherheitssysteme

1. 2 Zauberkugeln aus Öl und Wasser (Ansprechpartner: Julian)
   

Fazit/Ideen: Idee gut, aber entspricht durch sehr starke chemische Hintergründe weniger dem Gedanken von iGEM, aber mögliche Kooperation wird im Hinterkopf behalten

1. 3 Using AV/AAV as vector for iGE (Ansprechpartner: Volker)
   

Fazit/Ideen: Vorarbeiten nutzen: u.a. Mutationen von Virenhüllen, gut etablierte Produktionssysteme verwenden, Substanzen welche nicht mehr vom Immunssystem erkannt werden

1. 4 Reprogrammierte Viren als Krebs-Therapeutikum (Ansprechpartnerinnnen: Anissa und Kerstin)
   

WICHTIG:

Es wurde vorerst entschieden, sich das rAAV/AV-System näher anzuschauen und als Vektorsystem zu verwenden!!!!
Bei anderen gut etablierten, uns vielleicht noch nicht oder von euch bevorzugtem bekannten Vektorsystemen bitte bis nächste Woche (05.03.2010) vorstellen.
Das optimale System zu finden ist immer schwer, aber Entscheidung für ein System ist wichtig!!

Einteilung zur Themenbearbeitung bis nächste Woche:

Themen

• Immunogenität, Tropismus, Viruskapside, Infektiösität: Patrick, Adrian, Bea
  
• Produktion (Helferplasmide, rAAV): Dennis, Christian W, Stefan B.
  
• Sicherheit??: Volker
  
• Enzyme, Wirkstoffe, Promotoren: Igor, Anna, Kerstin, Anissa
  

Weitere wichtige Themen, welche in den nächsten Wochen anfallen werden:

Sponsoring (erste Vorschläge: Aldevron [Link unter Sponsoring]) und
Expertise (Virologie, Wilfried Weber BIOSS) in Freiburg einholen

iGEM Meeting 05.03.2010

• iGEM Verein
• Sponsoring
• Wiki Funktionen
• Vorträge

iGEM Verein

Auf dem Bankkonto des iGEM e. V. Deutschland befinden sich noch ca. 5000 € von letztem Jahr. Sämtliche Sponsorengelder sollten auf dieses Konto wandern und nicht zur Universitätskasse! Dennis und Jessika informieren sich über die rechtlichen Grundlagen die in Bezug auf die Ausgaben, die wir haben werden, wichtig sind. Alle Anwesenden (siehe Anwesenheitsliste) haben einen formlosen, schriftlichen Antrag auf die Mitgliedschaft im iGEM e. V. Deutschland gestellt und dem Kristian überreicht.

Sponsoring

Letztes Jahr hat sich Timo um dasd Sponsoring gekümmert. Die damals gefundenen Sponsoren sollten auf jeden Fall wieder angeschrieben werden (siehe iGEM Wiki 2009). DAAD sollte auch angeschrieben werden (ca. 5000 € letztes Jahr) . Volker kennt evtl. noch weiter Sponsoren. 2009 wurden keine Verlage (Springer u. A.) bezüglich Sponsoring angeschrieben. Dieses Jahr auf jeden Fall anschreiben.

Wiki-Funktionen

Volker hat die verschiedenen Wiki-Funktionen und Gestaltungsmöglichkeiten erklärt und demonstriert. Das Wichtigste: Wenn man etwas verändern will, muss man eingeloggt sein, auf edit drücken und schon kann es los gehen. Kristian empfiehlt den HTML-Code zu verwenden, der Wiki-Code ist aber wesentlich schneller zu schreiben.

Vorträge

Adrians Vortrag bezog sich auf das AV-System und die Immunreaktion. Da wir uns entschieden haben mit AAV/rAAV zu arbeiten, sind die in seinem Vortrag genannten kritischen Punkte fraglich, weil vorerst nicht bekannt ist in wie weit sie die Probleme bei dem AV-System mit denen von AAV/rAAV überschneiden. Genannt wurde unter anderem, dass nicht alle Mechanismen und Bestandteile bekannt sind, die eine Immunreaktion hervorrufen. Die Vorgänge in den Endosomen sind womöglich von Bedeutung, da diese letztendlich auch zur Antigenpräsentation führen können und somit zu einer Immunreaktion.

Patricks Vortrag bezog sich auf das Targeting/Tropismus-Modifikationen von (r)AAV. Die selektive Transduktion ist notwendig. Die besten Ergebnisse wurden dabei mit Hilfe von AK- oder AK-Fragmenten, welche an die Virusoberfläche gebunden waren, erzielt.

Dennis' Vortrag war sehr kurz ... es sollte um die Produktion von AAVs gehen

Anschließend wurde noch kurz das [http://www.molbiotech.uni-freiburg.de/iGEM/wiki2010/index.php/File:Freiburg10_1743-422X-2-43-6-l.jpg Bild] aus der Informationssammlung besprochen.

Angekündigte Vorträge für das kommende Meeting am 15.03.2010, 17:15 Uhr:

Dennis: Helfersysteme/Helferplasmide/Produktion

Volker: durchsucht die Patentdatenbank bezüglich Dennis' Themen

Adrian: Immunogenität

Patrick: Targeting

iGEM Meeting 29.03.2010

Die Klonierungs-Software ]Geneious Pro 4.8.3“ wurde von Tobias vorgestellt. Hierzu einige wichtige Tipps:

• immer erst am Rechner vorklonieren, dann im Labor nachklonieren!!! Dauert zwar manchmal ein paar Stunden, aber man vermeidet Fehler, die evtl. sonst bis zu 2 Monate Zeit kosten können!
  
• Klonierte Sequenzen und Restriktionsschnittstellen immer annotieren.
  
• Die hergestellten Vektoren werden (über Nacht von GATC) sequenziert (für die Proben gibt’s einen entsprechenden Briefkasten in der Bio II/III) und müssen mit dem theoretischen Vektor abgeglichen werden. Wichtig: Es kommt auf JEDES Nucleotid an, eine 100% Übereinstimmung ist erforderlich.
  
• Mit Hilfe des Programms können über die entprechende Sequenz auch auf Proteinebene Informationen gewonnen werden: Aminosäure-Sequenz, Gewichtsangabe, Länge, Extinktionskoeffizient,…
  
• Es gibt verschiedene Klonierungsstrategien (Infos unter: http://partsregistry.org/Catalog), ein Beispiel wurde von Kristian vorgestellt.
  
• Von den Plasmiden sollte immer die ganze Sequenz bekannt sein.
  

Eine kleine Gruppe hat sich bereit erklärt, sich etwas genauer mit der Software auseinanderzusetzen, um hierfür Ansprechpartner zu sein und um möglichst einen Überblick über das ]Kloniergeschehen“ zu behalten. Beim nächsten Meeting werden hierzu weitere Informationen bereitgestellt.

Was noch ansteht: Infos über Helferkonstrukte sammeln (Sequenzen); Modifikationen des AAV; Enzyme, die in den Virus verpackt werden, sollen bald bestellt werden.

iGEM Meeting 09.04.2010

• Website
• AAV-Biologie
• Sponsoring
• Infos zu iGEM e. V. Deutschland
• Sonstiges

Website

Die werdende Website wurde präsentiert (Link ?) www.molbiotech.uni-freiburg.de/iGEM . Die Seite sollte so eingerichtet werden, dass man nicht seitlich scrollen muss. Der ]Hohlraum“ muss noch gefüllt werden, entweder mit dem Logo oder einem Bild von der Uni, evtl. mit beidem (weitere Vorschläge ?). Die ]Bakterienzelle“ im Logo sollte noch verändert werden, so dass sie eher wie eine menschliche Zelle aussieht und die Assoziation zu einem Gesicht, dass sich gerade übergibt nicht mehr entstehen kann.

AAV-Biologie

Mit dem Programm GeniusPro 4.8.3 wurden Alignements von AAV1-7 gemacht und die konservierten Bereich zu identifizieren und ggf. feststellen zu können wo Modifikationen der Capsidstruktur ohne große Verluste möglich sein könnten. Der Vergleich der Ergebnisse mit der Bereits besprochenen Literatur steht noch aus.

Es gibt ein 3-Plasmid-Sysmten zu kaufen: pAAV-MCS, pAAV-RC2, pHelper (E.coli Plasmide). Dieses kostet ca. 1500 €. Für iGEM wäre es sinnvoll sowohl mit dem gekauften als auch mit einem ]eigenen“ System zu arbeiten, um auf jeden Fall Ergebnisse zu bekommen. Alle rAAV sind S2.

Adrian wird, sobald sein Großpraktikum vorbei ist, sich mit dem AAV-Modelling beschäftigen.

Volker wird in Heidelberg und Berlin nach Vektoren fragen.

Allgemein brauchen wir auf jeden Fall ein grundlegendes Verständnis für die Plasmide und Proteine. Es wurden zwei Gruppen gebildet: Bea, Kira und Johannes kümmern sich um das Enzym bzw. wie man es in die Zelle bekommt. Hanna, Annissa, Bea, Julian, Jessika, Kerstin, Patrick, Adriian und Kira werden die Vektoren planen.

Sponsoring

Der Brief an die Sponsoren ist noch in Arbeit. Der aktuelle Entwurf wird hochgeladen. Es sollten mehrere Entwürfe verfasst und je nach dem wen wir anschreiben, verwendet werden.

Infos zu iGEM e. V. Deutschland

Die Steuergrenze bei gemeinnützigen Vereinen liegt bei 17.000 €

Wenn wir Werbung machen (im Sinne von Logos platzieren für Spenden), müssen wir eine Umsatzsteuer bezahlen. Wenn Wir Werbung machen wollen, muss es in der Vereinssatzung stehen. Wenn in der Satzung steht, dass der Verein Werbung macht, dann muss eine Gewerbesteuer bezahlt werden. Es muss noch überprüft werden ob die alte Vorstand entlastet werden kann, ohne dass daraus Probleme für die neuen Mitglieder entstehen. Der Verein braucht mindestens 7 Mitglieder.

Sonstiges

1750 $ Anmeldegebühr für iGEM 2010 wurden bezahlt.

Jeder von uns soll sich bei iGEM anmelden und mit iGEM Freiburg assoziieren.

Julian und Igor haben sich bereit erklärt am 15.4. unser Projekt dem Labor präsentieren.

Am Donnerstag den 22.4.2010 ist um 9:30 der Fototermin, anschließend die Laboreinführungund dann gibt es Café und Kuchen.

Dies wird auch die Vereinssitzung sein.

iGEM – Meeting 29.4.2010

• Bea stellt kurz die Tagesordnungspunkte vor.
• die eMail war von Adrian, Beschwerden möchten bitte direkt an ihn gerichtet werden
• Volker telefoniert noch mit dem Direktor einer AAV-Einrichtung ob sie ein System zur Verfügung stellen würden
• Abstimmung über das Logo: Sonne mit Farbabstufung, Volker testet noch andere Farbvarianten
• es kam die Frage auf, ob man parallel schon mit dem Blog beginnt
• man kann sich auf der iGEM-Seite registrieren und unserem Team beitreten
• die Frage nach dem Sponsoring/Werbung
• Aufgaben wurden verteilt (siehe externe Liste)
• der 2. Klonierkurs beginnt am 03.04.10, die Plätze wurden verteilt
• die Terminplanung für die Laborbelegung wurde begonnen
• es sollten alle Termine online gestellt werden (wiki/Google-Kalendar)
• Volker hält einen Vortrag über iGEM auf der BuFaTa

iGEM - Meeting 06.05.2010

Protokoll: Volker Leitung: Bea

• Bea verteilt Übungen zum Thema ]Rechnen im Labor“ . Nach 45 minütiger Bearbeitung wird eine gemeinsame Besprechung durchgeführt, die von Kristian geleitet wird.
• Abstimmung über das Logo, es wird mit 19 Fürstimmen bei zwei Gegenstimmen für das blaue Logo gewählt. Volker will nun verschiedene Versionen des Logos hochladen.
• Die Fortschritte der Internetseite werden besprochen. Gute Fortschritte wurden erzielt. Gleichzeitig wurde um Mithilfe bezüglich der Vervollständigung der einzelnen Rubriken wie Historie, über iGEM etc. gebeten.
• In der Zukunft sollen Meeting immer stattfinden: Donnerstag um 10 hst (=10.00)
• Nächstes Meeting Freitag 14.05.2010 hst (=12.00)
• Besprechung der Wochenplanung. Es wird gebeten dies besser zu verteilen.
• Es wird auf das neue Teammitglied Dennis eingegangen, man beschließt ihn besser kennen lernen zu wollen. Es wird vorgeschlagen ihn zu bitten ein kurzes Statement zu seiner Studiensituation und seinem geplanten Engagement bei iGEM abzugeben. Bea erklärt sich bereit ihn per e-mail anzuschreiben.
• Um das Kennenlernen und die Integration aller in das Team voranzutreiben wird beschlossen ein Grillen auf dem Fachschaftsdach zu veranstalten. Als Termin wird der 17.05.2010 ab 18.00 Uhr beschlossen. Im Anschluss besteht die Möglichkeit den Abend beim Tag eins am Waldsee ausklingen zu lassen.
• Volker merkt an, dass er die Literatur in diesem Jahr für sehr umfangreich erachtet. Andere meinen dass die Literatur noch nicht wichtig ist und man sich darum später kümmern könne. Einzelne fühlen sich von der schieren Masse an Publikationen auf dem Wiki erschlagen. Schlussendlich wird beschlossen die Themen einzuteilen und so die Bearbeitung durch Einzelne zu erledigen.
• Die Themen werden wie folgt verteilt:
  • Zellkultur / 293-Zellen: Johannes
  • ITRs: Achim
  • Detektion: Volker
  • Capsid: Patrick
  • Aufreinigung: Christian
  • Manual: Bea
  • Infektionsmechanismus: Adrian
  • Antikörper: Stefan
  • Thymidinkinase: Hanna u. Bea
  • Assembly: Hanna
  • Genom : Melanie
  • Helferplasmide: Anissa, Anna u. Kerstrin
  • Immunantwort: Jessica
  • Zeitansatz ist der 20. Mai.
• Ende des Meetings

Und wie siehts aus mit Cytosin Deaminase? Ich kann uebernehmen (Kira)

iGEM - Meeting 14.05.2010

Protokoll: Hanna

1. Sponsoring:

• Anna und Igor stellen den Sponsorenbrief vor. Dieser wurde gemeinsam überarbeitet.
• Hanna stellt die iGEM Seite der LMU München von 2010 vor: -> Die Sponsorenauflistung könnte eventuell auch für uns interessant sein :) Der Link hierzu: http://iGEMlmu2010.forumprofi.de/viewtopic.php?f=5&t=29
• Das Sponsorenteam wurde eingeteilt: Anissa, Kerstin, Anna und Igor (Bio-Firmen, andere Firmen, Stiftungen, Presse).
• Fabian schlägt vor, beim Europapark (von dem bereits öfter bestimmte Projekte gefördert wurden) anzufragen v.a. auch im Zusammenhang der jährlich dort veranstalteten ]Science Days“
• Volker ermittelt den Katholiken-Anteil im Team, um abwägen zu können, ob man bei der Gebrüder Büschbell Stiftung (Sponsoring von Reisen) anfragen könnte.
• Es wurde beschlossen, dass Pressemitteilungen und Artikel für Laborjournal, Zeit Campus etc. erstellt werden sollen. Hierfür haben sich Jessica und Volker bereit erklärt.

2. Homepage:

• Fabian weist darauf hin, dass alle Texte bis spätestens morgen (Samstag) fertiggestellt sein sollten und an Fabian und Kristian (Proof reading :) ) geschickt werden sollten. Die Homepage sollte so schnell wie möglich fertig gestellt sein (bis Sonntag).
• Bea und Hanna merken an, dass Dr. Feuerhake (Mediziner, Leiter des Neuropathologieseminars) bereits Interesse an dem Link der Homepage und an Sponsorenbriefe zeigte.

3. Laborarbeit:

• Zellkultur: Patrick, Stefan B., Chris W., Adrian bekamen eine Einführung von Sven. Am Montag: Jessica und Volker.
• Ein Standardprotokoll wurde hierzu erstellt.
• Adrian, Bea, Chris W. und Hanna haben nach der Funktion des beta-Globin-Introns hinter dem CMV Promoter des pAAV_MCS gesucht. Vermutet wurde, dass es sich hierbei um ein Promoterelement oder Insulator handeln könnte. Eine Anfrage bei Stratagene lieferte nur ungenaue Infos: Es handelt sich um ein Intron des humanen beta-Globins, flankiert von Spleißakzeptor und Spleißdonor Sequenzen der E2 und E3 Exons. Das Herausspleißen führt (irgendwie) zu einer höheren Akkumulation des Gene of Interest im Cytoplasma. (Siehe Rundmail von Adrian)

4. Volker liest eine Email von Dr. Jürgen Kleinschmidt aus Heidelberg vor:

• Die Plasmide werden diesen Monat an uns verschickt.
• Wir sollten vor der Verwendung bestimmter Vektorplasmide bei den entsprechenden Konstrukteuren nachfragen, ob diese weiterverwendet werden dürften.
• Dr. Kleinschmidt veröffentlich nächsten Monat ein Paper über ein viertes virales Genprodukt (VP4), welches beim Assembly eine Rolle spielt.

5. Zeitplan:

• Bea stellt anstelle eines konkreten Zeitplans einen ]Milestone-Plan“ vor (entworfen von Bea, Adrian, Hanna). Dieser solle dazu dienen, dass nachgeschaut werden kann, was bereits gemacht wurde, was getan werden muss etc. Unterteilt in ]Theorie“ und ]Praxis“ kann man sich an ihm orientieren und Dinge ]abhaken“ (=grün unterlegen), die erledigt wurden. Hier im Wiki ist dieser unter ]Zeitplan“ zu finden.
• Für die Erstellung eines Zeitplans wurde noch keine zufriedenstellende Lösung gefunden (Vorschläge sind erwünscht!)

6. Grillfest am Montag, den 17.05.2010: Chris W. verkündet, dass wir auf dem Dach der Fachschaft grillen und auch den Grill benutzen dürfen (gegen einen Kasten Bier – wenn Grill nicht geputzt wird, 2 Kästen :) ). Basierend auf der Wettervorhersage am Sonntag wird beschlossen, ob gegrillt werden kann oder ob wir Pizza essen gehen (Adresse: Pizzeria La Piazza, Rathausgasse 50, 79098 Freiburg). Per Rundmail und Wiki werden dann alle informiert. Laut Chris W. könnten wir Teller und Besteck ]theoretisch“ von der Fachschaft bekommen, jedoch muss noch nachgefragt werden (Chris). Außerdem wurde eine Liste mit Salaten, Nachtisch etc, die mitgebracht werden, erstellt: File:Freiburg10 Grillen.jpg

Fleisch, Würstchen etc sind von jedem selbst zu organisieren!

7. Sonstiges:

• Es wird darauf hingewiesen, dass für die Reise nach Boston ein gültiger biometrischer Reisepass notwendig ist. Fabian merkt an, dass nicht-EU Bürger eventuell noch (rechtzeitig!) ein Visum beantragen müssen!
• Volker erinnert daran, dass bis zum 20.05. die Literatur fertig bearbeitet sein sollte.
• Bea informiert über einen Vortrag über Krebstherapie (irgendwo) im Uniklinikum am 1. Juni. Bei Interesse an Bea wenden!

iGEM - Meeting 20.05.2010

Tagesordnungspunkte

• Presse
• Update: Sponsoring und Homepage
• Update: Laborarbeit
• Zeitplan-Einteilung
• Update: Literatur-Recherche
• Sonstige Anmerkungen
  

Start 16 Uhr

Presse

• Jessica hat verschiedene Magazine angeschrieben und bereits positive Antworten erhalten
• Es sollen verschiede TV-Sendungen angeschreiben werden z.B. Quarks&co oder nano. Mehrere Teilnehmer stehen für die TV-Aufzeichnungen zur Verfügung. Näheres wenn es konkret wird.

Pressemitteilung

• Die Pressemitteilung wurde vorgestellt und gemeinsam verbessert (wird noch mal zur Kontrolle an Kristian geschickt)
• Der erste Absatz soll etwas überspitzt klingen :)
• Die Pressestelle der Uni erhält das Schreiben, welches dann an den allgemeinen Verteiler geht.

• Kristian fragt wegen Ethik-Projekt. Was könnte man machen? Zur Bio-Sicherheit sollte ca. eine Seite geschrieben werden. Mögliche Ansätze: Umfragen.

Sponsorenbrief

• Viele Anfragen sind bereits versendet worden.

Verein

• Bea und Volker übernehmen die Position von Julian im Vorstand. Julian ist nicht bereit den Vorstand weiter zu machen. Somit vergrößert sich der Vorstand um ein Mitgleid.

• Jessica hat neue Spendenquittung geschrieben und im Wiki hochgeladen.

Homepage

• iGEM-Text ist zu lange und muss gekürzt weden. Die Seite sollte so gestaltet werden, dass das Team vorgestellt wird und über einen Link dann auf den iGEM-Text zugegriffen werden kann. (Fabian)
• Ebenso muss die Software-Team Seite gestaltet werden
• Informationen-Seite muss noch der Text wie wir gesponsert werden können rein. Vielleicht Teile des Sponsorenbriefs verwenden? (Fabian)

Update Laborarbeit

• Hanna: Das Klonieren muss über einen Zwischenschritt erfolgen. YFP wurde gestern in pCMV_MCS einkloniert, Trafo wurde gemacht. Nächste Woche wird Expressionskasette mit dem YFP aus dem pCMV_MCS rausgeschnitten und in pAAV_MCS über NotI einkloniert.
• Kristian: Das Laborbuch muss so gestaltet sein, dass es auf das iGEM-Wiki kann (es muss dort hin). Alle Klone im Kühlschrank müssen ein Datum haben. Wichtig ist aufzuführen woher die Sachen kommen (wer hat sie wem gegeben).
• Adrian: Parallel wird eine Exceltabelle mit allen vorgenommenen Schritten geführt.

• Konstrukte weiter aufteilen: wer kann wann im Labor arbeiten, wer will ins Labor und wer hat eine Einweisung (die mit einer Einweisung sollten dehnen ohne helfen).

• Adrian schreibt eine Mail an alle, damit sich niemand übergangen fühlt.

Laboreinteilungsplan

• Bea hat neuen Zeitplan erstellt.

http://www.molbiotech.uni-freiburg.de/iGEM/wiki2010/images/2/25/Freiburg10_Time_plan_20.05.2010_01.06.2010.pdf

Kartenfreischaltung

• Folgende Teammitglieder erhalten über ihre Unicard Zugang ins Labor:
  • Hanna
  • Patrick
  • Bea
  • Jessica
  • Adrian
  • Christian W.
  • Volker

Literatur-Recherche

• Volker: Informationssammlung zum AAV muss bis nächsten Montag fertig sein (Heute wäre der Stichtag gewesen). Die Zusammenfassungen vorerst als Word-Dokument hochladen, falls die Dateien nachbearbeitet werden müssen. Später soll ein Wiki daraus gemacht werden.

Sonstiges

• Kristian: Kartuschen zur Beschriftung nachbestellen, damit die Eppis richtig beschriftet werden können (auf Vereinskosten bestellen)

• Anfrage für Studenten-Kursmittel. (Kristian hat die frist vermutlich verpasst)

• Cap neu planen

• Ab der zweiten Juniwoche wir sehr viel Laborarbeit anfallen.

• Nächsten Donnerstag halten Hanna und Bea ihren Vortrag.

• Termin für das nächste Meeting: Donnerstag 27.5. um 10 Uhr c.t.

• Verantwortlicher für iGEM-Anforderungen (requirements) gesucht (vertagt).

• Wir sollten für andere Teams als Ansprechpartner gelten.

• Bea: Kongress in Heidelberg am 8.6. Dabei könnte Herr Kurz besucht werden und eine Kleinigkeit als Dankeschön übergeben werden (Geschenkkorb). Wer Interesse hat, bei Bea melden.

• Kristian: BGM Mitglied werden? Es gibt Studiengruppen (Untergruppen mit günstigerem Beitragssatz) – Vorteile wie z.B. Reisekostenübernahme

Ende 18:45 Uhr

Eine Anmerkung zum Ablauf der Sitzungen: Wir sollten Punte wie Update Laborarbeit an den Anfang ziehen, da diese Infos recht wichtig sind. Punkte wie heute der Brief ermüden doch sehr.

iGEM Meeting 27.05.2010

Labor:

Vortrag von Bea& Hanna über die Fortschritte der Kloniertruppe: File:Freiburg10 Vortrag Bea Hanna.pdf
Wesentliches Ziel war es YFP in die pAAV MCS zu integrieren. Mit der Integration des YFP wurde jedoch eine zusätzliche Not 1 Schnittstelle hinzugefügt.

Die genaue Funktion des β-Globin- Introns ist noch unbekannt. Des Weiteren herrscht Unklarheit über die Transkriptionsfaktoren und den genauen Transkriptions-Startpunkt des CMV Promotors.

Kurzfristige Ziele:

Pst1 Schnittstellen aus den ITRs über synthetische Oligopeptide entfernen. Die Oligopeptide wurde bereits bestellt und werden am Montag verschickt.

Bei der Kalkulation und Berechnung von zu pippetierenden Volumina bietet es sich an die Ergebnisse einer Kontrolle zu unterziehen.

Tobias weist darauf hin, dass es in Genious sowohl ein Feld für Vorwärtssuche, als auch ein Feld für die Rückwärtssuche nach Sequenzen gibt.

Die Identifikation der Inhalte einzelner Eppis soll durch Nummern auf dem Deckel gewährleistet werden. Diese sind in denen hierfür erstellten Excel- Sheets einer genauen Beschreibung des Inhaltes zugeordnet. Die Excel- Sheets wurden in den Kategorien Plasmide, Oligos, Bakterienkultur, Eukaryonten und Primer erstellt. Adrian weist darauf hin dass dieses vielversprechende Ordnungssystem nur dann funktioniert wenn es von Anfang an eingehalten wird.

Nächste Vorträge: 10.Juni: Volker & Chris W.

24.Juni: Adrian & Patrick

Literatur:

Erinnerung: Vergesst nicht die von euch bearbeitete Literatur aufs Wiki zu laden

Presse: Jessica hat verschiedene Magazine und Fernsehsendungen kontaktiert. Sowohl ]Bild der Wissenschaft“ als auch der Spiegel haben Interesse bekundet über unser Projekt zu berichten. Die Spiegel Redakteurin Cinthia Briseño (promovierte Biochemikerin) will sich telefonisch mit dem Labor in Verbindung setzen. Eine Checkliste neben dem Telefon mit den wichtigsten Projektdaten und Auskünften die an die Presse weitergegeben werden sollen könnte sich als im Gespräch Hilfreich erweisen.

Hompage: Die Informationen für die Sponsoren sollten baldmöglichst online gehen. Fotos die auf der Homepage erscheinen sollten das i Gem-Team und dessen Arbeit auf geeignete Weise präsentieren.

Es sei daran erinnert, dass jeder der nach Boston fliegen möchte einen biometrischen Reisepass benötigt. Zur Zeit 3-4 Wochen Fertigungsdauer. Gegen Aufpreis innerhalb von 3 Tagen zu haben.

Wer nicht in Besitz der deutschen Staatsbürgerschaft ist möge Erkundigungen einholen ob er ein Visum beantragen muss.

Team-Bildung:

Spaß und Freude an der Arbeit sind maßgebliche Bewertungskriterien innerhalb des i Gem- Wettbewerbes.

Um unser Soll zu erfüllen sind folgende Aktionen angedacht: Grillen Kanufahren Europa-Park Kino/Filmabend

Die Termine sollen per Doodle festgelegt werden. Jessica arbeitet in einer Kajakschule und kann vergünstigt Boote undAusrüstung organisieren. Fabian ist bereit sein Auto mit Anhängerkupplung zum Transport zu Verfügung zu stellen. Adrian möchte eine Sponsoringanfrage an den Europapark stellen um vergünstigten Eintritt zu erwirken.

Sponsoring:

Auf der Website des Scie-Talk erscheinen folgende Sponsoren, die vielleicht auch für uns interessant sein könnten. -Boehringer Ingelheim -Vita 34 -Oncotest -Oncotherm Nachzulesen unter: http://bts-ev.de/index.php?id=1506

Nächstes Meeting: 10 Juni: 10.ct

iGEM Meeting 10.06.2010

Vortrag: Chris und Volker halten einen ]progress report“ über die Laborarbeit: Bitte Powerpoint hier einfügen!
Außerdem liefert Volker einen kurzen Überblick über die Kleinschmidt-Plasmide:
-> System von Grimm et al. (1998): pXX6 (Adenovirus Helfergene), pDG (komplettes Helferplasmid)
-> Vektorplasmide, in die Genes of Interest kloniert werden können: pTRUF_CMV_eGFP (single strand), dsAAV_CMV_eGFP (self-complementary Expressionsvektor). dsAAV_CMV_eGFP erscheint effizienter zu sein. Vermutung (Kristian): ssAAV wird schneller abgebaut. Volker: ssAAV braucht länger bis Gene abgelesen werden auf Grund der Zweitstrangsynthese, die wohl recht langsam verläuft.
-> zu beachten: AAP (assembly activating protein) im VP2 CDS. Frage: Wenn VP2 ]herausgekickt“ wird, geht dann die Expressionsrate in den Keller? (Recherche nach Deletionsstudien!)

Cytosindeaminase:
Es wurde noch nichts bestellt. Es stellt sich die Frage, ob man bestellen soll oder ob man diese irgendwo anders beziehen kann (To do: Wo?). Volker: Bei ESBS nachfragen (Kooperation).

ScieTalk Report (Adrian):

• Insgesamt gab es nichts für uns verwendbares.
• Das einzige, das in ]unsere Richtung“ ging, war ein Buschratten-Lentivirus-Vortrag
• Interessant war ein Tumor-Genom-Projekt: Das Prinzip hierbei ist, dass Genome von einer bestimmten Anzahl an Tumoren durchgescannt, sequenziert und entsprechende Mutationen detektiert werden.
• Es wurde die Firma Boehringer-Ingelheim wegen Sponsoring angesprochen. Adrian ist hierbei guter Dinge, dass wir von dieser unterstützt werden könnten. Infos werden der Kontaktperson zugeschickt.
• Herr Kleinschmidt hat als Dank einen Geschenkekorb überreicht bekommen. Vermutung: Wir bekommen die Sequenzen der Plasmide, wenn er sie hat.
• Allgemein war es interessant und durch den potentiellen Sponsor und einen Stift für Bea konnte eine positive Bilanz gezogen werden.

Sponsoring (Igor):

• Bisher sind sehr wenig Antworten gekommen.
• Nächster Schritt: Anrufen.
• Kristian möchte wissen, was mit Qiagen ist (Anissa!)

Laborjournal:

• Bitte immer gleich führen!
• Sven weist darauf hin, dass die Lab-Arbeit vernünftig übergeben werden muss, wenn neue Leute hinzustoßen/weitermachen. Einfache Fehler können somit vermieden werden.
• Tobias merkt an, dass die Oligo-Beschriftung ein Update benötigt.
• Kristian schlägt vor, eine Kurzanleitung zu verfassen, wie Plasmide, Oligos etc. beschriftet werden sollen.

Presse: (Jessy)

• Jessica hat eine Ansprechpartnerien bei Nano, die über uns berichten möchte. Die Idee ist, dass diese öfter vorbeikommt, um die Entwicklung zu dokumentieren. Da momentan noch nicht viel zu sehen ist, wird sie erst dann kommen, wenn etwas ]leuchet“ (mVenus)... also hoffentlich bald :) Die Sendung soll dann im September ausgestrahlt werden. Allerdings möchte die Reporterin auch etwas über Heidelberg berichten.
• Bild der Wissenschaft: Plant einen Bericht über uns in der Augustausgabe. Aus diesem Grund wird jemand in der ersten Juliwoche anrufen oder zum interviewen direkt vorbeikommen (hierbei sollten meherere + Kristian dabei sein).
• Deutschlandfunk: Tobias merkt an, dass jemand am Donnerstag (Feiertag) angerufen hat und überrascht war, dass Kristain nicht da war :)

iGEM Workshop am Wochenende:
Tobias, Sven, Bea und Fabian fahren hin (Paris). Dort werden Richtlinien, Veränderungen etc. vorgetragen, die für iGEM eingehalten werden müssen. BIOSS verlangt einen Bericht über diesen Workshop.

Kooperationen:

• Volker hat bei ESBS angefragt und schlägt vor, sich auf ein Bierchen mit diesen zu Meeting oder ]ein bisschen DNA auszutauschen“ :) Das ESBS Team plant etwas mit Photorezeptoren und Downstream-Signalling in Prokaryoten zu machen.
• Es stellt sich die Frage, ob man eine Kooperation mit München anstreben sollte, da diese etwas mit Apoptose machen.
• Des Weiteren hat das Schweden-Team Interesse an Freiburger Material bekundet.

Stickaufnäher:

• Anna kann womöglich Polo T-shirts besorgen.
• Volker schlägt vor, Stickaufnäher des Logos zu bestellen. Diese würden jeweils 2,40 € kosten (9 x 6 cm). Vorschlag: Man könnte diese auch auf ein paar Laborkittel (lose) nähen, z.B. für die Nano-Reportage. Hierzu herrschte allgemeines Interesse. Aus diesem Grund werden nun die Kosten ermittelt und Probeexemplare verlangt.

Modellsimulation:
Kristian weist darauf hin, dass wir Simulanten benötigen, die unser System mathematisch erfassen (Differenzialgleichungen zu beispielsweise Promoterstärken, Plasmide mit unterschiedl. Effizienz etc.). Ziel ist der Entwurf eines mathematischen Modells mit Hilfe von Mat-Lab, was entkoppelt von der Lab-Arbeit laufen soll. Es stellt sich die Frage, ob sich jemand im Team (mathematische Begabung erwünscht :) ) damit befassen möchte oder ob Informatiker/Mathematiker/Physiker gesucht werden sollen. Sven merkt an, dass es zu Mat-Labs ein Seminar gibt, für das man sich allerdings früh genug anmelden muss. Außerdem müssen Lizenzen für dieses Programm beantragt werden.

Fun:

• Asia Woche im Aldi
  
• Grillen: Mittwoch (16.6.) ab 18 Uhr auf dem Dach der Fachschaft. Die damalige ]Mitbring-Tabelle“ wird übernommen (siehe: Meeting 14.5.2010). Wenn jemand nicht dabei ist, bitte bescheid sagen - die, die sich nicht eingetragen haben und was mitbringen: sehr gerne :)
• Movie-Night in der Zoologie: findet als Kooperation zwischen iGEM und Fachschaft statt. Nächste Woche wird es hierzu (mal wieder) eine Doodle-Umfrage geben.
• Kanufahren: Die Sondergenehmigungen für das Naturschutzgebiet kommen nächste Woche. Es wird noch nach einer Grillstelle für nach dem Kanufahren gesucht. Eine detaillierte E-mail wird Jessy noch rumschicken (Vielen Dank schonmal für die Orga!).

To do:
1. Theoretisch:

• Wo genau befindet sich die Kernlokalisationssequenz? Adrian weist hierzu auf die N-Termini von VP1 und VP2 hin. Genaueres sollte noch recherchiert werden!
• Proteomics-Analyse finden. Kristian kann sich nicht vorstellen, dass DNA alleine verpackt wird.

2. Praktisch:

• Test Transfektion mit pAAV_iGEM_mVenus-YFP und pTRUF_CMV_eGFP
• Deletion der NgoMIV Schnittstelle im f1 Ori. Kristian: f1 ist für uns nicht so wichtig, könnte im Prinzip entfernt werden.
• Überlegung: VP3 exprimieren und in vitro zusammenbauen -> schauen, ob man Viruspartikel bekommt.
• Wenn Mini-Prep Kit da ist: Sofort RNAse und EtOH reinmachen!
• Zellkultur: Am Freitag (11.6.) sollen die Zellen dünn ausgesät werden, damit am Montag damit gearbeitet werden kann.
  

Nächstes Meeting: Donnerstag, 17.06.2010, 10 c.t. Uhr. In 4 Wochen halten Achim und Jessy einen Vortrag.

iGEM Meeting 17.06.2010

Bea und Fabi stellen Ergebnisse des iGEM Workshops Europe in Frankreich, Evry vor: File:Freiburg10 iGEM Workshop Europe June2010.ppt

• Headquarter: Randy Rattberg, Tom Knight (RFC10), Meagan Lizarazo (Orga), Drew Endy (Partsregistry, Biofab -> im Hochdurchsatz Parts generieren)
• iGEM standard parts:
  • Parts & Devices: DNA -> Parts -> Device (in Vektor klonierbar, alleine nicht funktionstüchtig, z.B. Promoter mit GFP) -> System
  • Standard biological parts: BioBrick part, flankiert von Präfix und Suffix -> BioBrick plasmid backbone
  • NotI ist im RFC10 ein Spacer. Frage: Stört NotI in Parts? (Tom Knight: NotI darf im Part nicht vorkommen! -> (http://openwetware.org/wiki/The_BioBricks_Foundation:BBFRFC10)
  • Assembly method: Mit 2 Enzymen schneiden (z.B. Plasmid 1: EcoRI + XbaI und Plasmid 2: SpeI + PstI), Mixen und Ligieren -> XbaI und SpeI haben kompatible Überhänge und generieren keine neue Schnittstelle
  • Scars = Klonierungsnarben zwischen ligierten Parts -> annotieren! (dies erfolgt eventuell nicht in der Partsregistry!)
  • Auf sich abbildende Klonierung: Standard Assembly
• Wichtige Homepage: http://www.partsregistry.org/Main_Page Dort zu finden:
  • Katalog
  • Help Funktion
  • Search parts: Sequenz, Part bestellbar?, Stern rechts oben = wurde im Distribution Kit mitgeschickt, ? = Erklärungen dabei, A=liegt beim Headquarter vor, wurde jedoch nicht mitgeschickt – kann auf Anfrage erworben werden.
  • Kristian: Wenn DNA aus dem Kit verwendet wird: Quality überprüfen!!!
  • Bei iGEM eingeloggt, kann man editieren! (Der, der das Part einträgt, hat mehr Rechte, deshalb von Kristians Account!)
  • Search: Text, Subpart , Superpart (-> Heraussfinden, wo Part überall enthalten ist)
  • Sequence analysis (]Tools“): Blast search, Möglichkeit zu schauen, ob es bestimmte Parts in der Datenbank schon gibt
  • Experience: Diskussionsplattform, Austausch von Erfahrungen in Form eines Forums
  • Nur S1 Produkte sind erwünscht! -> Plasmid-DNA ist in Ordnung ;)
  • Gefahrenhinweise sind in der Registry nicht möglich.
  • ]Highlight Parts“: Die am besten dokumentierten Parts werden herausgesucht und auf der Homepage präsentiert.
  • Deadline, bis alle Parts dort sein müssen! (Mind. 5 Tage vor dem Termin abschicken), Dokumentation der Parts muss ebenfalls bis zum Wikifreeze fertig sein!
  • Besonders gut dokumentiere Parts im Wiki verlinken (-> Registry), Kristian: Sequenzen doch noch mal Komplett im Wiki ablegen!
  • Parts types: BBa_B, BBa_C, BBa_E,…, Plasmide haben ihre eigene Nomenklatur.
  • Nur wenn man eingeloggt ist, sieht man das Plasmid, die Sequenzierung, etc., es ist leider nicht gekennzeichnet, in welchem Standard das Part ist (RFC10, RFC25,..?) -> Sequenzierung anschauen :)
  • Plasmidnamen, z.B. pSB1AK3: AK = Antibiotikaresistenz, 3 = Versio-No.,..
  • Alignments, Test Verdau, Antibiotika-Tests etc. sind bei Parts abrufbar.
• Requirements:
  • Präsentation (20 Minuten = WIRKLICH NUR 20 Minuten!!! :) , 5 Minuten Fragen, 5 Minuten Wechsel der Teams = 30 Minuten), Virusgrafik (Video von Nano?) -> man braucht was besonderes, keine Standard-PowerPoint – Gradwanderung zwischen lächerlich und Aufmerksamkeit erwecken
  • Wiki-Freeze: 1 Woche vor Abflug ->Strickt 12 Uhr!!! (letzte 4 Stunden: ständig Timeouts, Verzögerungen etc.)
  • Parts in Wiki UND Registry
  • Poster müssen am Freitag abgegeben werden. ]Wir müssen hier aus der Masse abheben “ (Kristian) -> Ideen
• Next year:
  • Erwartung: 180 Teams = 1800 Menschen
  • Regionale Vorentscheide in Asien, Nordamerika, Europa. Die besten qualifizieren sich für die ]Weltmeisterschaft“ am MIT -> regionale Headquarters
• After iGEM:
  • 1 Monat schlafen (Sven)
  • iGEM Alumni Association
  • IET, IBE: Veröffentlichung der Arbeit
  • Registry Labs: Anmelden!
  • Rechtlich gesehen ist iGEM und BioBrick Foundation getrennt.
• Take Home Messages:
  • Qualität geht vor Quantität = lieber weniger Parts, aber gut dokumentiert!, Bsp: BBa_F2620
  • ]Get and Give“ = Philosophie von iGEM
  • Parts, Ideen und Erfahrungen teilen
  • Projekt in kleinere Etappen einteilen, anstatt eines großen Ziels
  • Leave an impression (Präsentation: Virusgrafiken etc. -> Ideen erforderlich!)
  • Have fun

Kooperationen:
Trend: Kooperationen, um manche Arbeitsbereiche auszulagern. Vorschlag Tobi: Heidelberg, da die eine siRNA Datenbank mit Viren erstellen.

Lab-Update:

• Workflow: Wissen und Fragen sammeln! Morgen Meeting, um das ausführlich zu machen.
• Planung ITRs, Problem: Targeting, bei dem überlegt wird, die Poren zu verstopfen vs. Helikase, die ssDNA in Virus durch Poren schleußt!
• Freitag: Transfektion pAAV-iGEM-MCS_mVenus-YFP – Sven: Zellen wurden sehr dünn ausgesät, Inkubation über das WE, Aufreinigung am Montag (Frage: Infizieren sich die Producer Cells selbst nicht? Warum nicht?)
• TK-GMK: Vermutung, dass wir im Konstrukt die WT-TK haben -> Primer wurden designed, Sequenzierung erfolgt -> Frage, woher wir die TK30 und SR39 bekommen.
• Vorschlag: Literatur-Gruppen

Qiagen:

• Titerbestimmung: Primer selber machen (Volker: Primer, die im CMV Promoter binden), Q PCR Kit von Qiagen (Anzahl der Genome), ELISA (Anzahl der Capside) -> in Kombi Verpackungseffizienz überprüfbar.
• DNA Reinigungskits: Aus Zellen und aus Überstand

Logo:

• eukaryotische anstatt prokaryotischer Zelle
• Stickerei: Problem, dass Gradienten nicht verwirklicht werden können
• 7 x 7 cm

MATLAB:

• Uni besitzt 50 Accounts an bestimmten Rechnern.
• Wir wollen selbst Lizenzen -> Registrieren! (~ pro 5 Leute 1 Lizenz)
• Steffi hat ab 22. Juli Dipl.Prüfung rum, kennt sich mit MATLAB aus und hilft uns.
• Support von ZBSA
• Beispiele der Jahre zuvor

Verein:

• Bis 17500 steuerbefreit
• 17500 – 35000 7% Steuern (Körperschaft- und Gewerbesteuerfrei)
• Empfehlung falls darüber: Förderverein
• Logo/Sponsoring: Größe der Logos auf der Homepage -> zweckgebunden vs. Wirtschaftlich (-> Umsatzsteuer) – wenn klein genug, fällt das nicht in Steuerfall hinein – Vermutung: Unsere Logos sind zu groß.
• Vorstände können bis zu 500 Euro im Jahr bekommen.

Upcoming events:
Samstag um 10:30 Uhr Meeting für Literatur-Diskussionsrunde, Treffpunkt am Eingang der Bio II/III
Donnerstag: 10 c.t. Uhr, Vortrag von Adrian und Patrick

iGEM Meeting 24.06.2010

Presentation Adrian and Patrick: Lab Update 10.6.-17.06

• ITRs:
• Scheme of ITRs (Achim) Yellow boxes correspond to mutated sequences in the Stratagene vector compared with the wtITRs
• Rep proteins bind on RBE
• Problem: which sequences can be changed? Verifcation: Did Stratagene change the left ITR on purpose?
• Practical work:
• Site-directed mutagenesis of ITRs did not work
• Order genes of ITRs and PCR (parallel approach)
• Mr. Gene: price per bases??(Bea)
• ask for more points (advertisment)
• set-up fee??
• helper protein E4
• possible solutions: Rep proteins interacts with CMV promoter, secondary structure formation?? (Volker??)
• sequence analysis of GMK-TK
• GMK-TK30 is the construct we received of M. Black and Amor
• SR39
• wtTK: receive DNA from Freiburg
• CMV_forward reverse/forward Primers
• Rohr et al. (2002, 2005) published primers which prime forward
• Volker ordered the right primers (already received)
• Nuklease S1, Proteinase K are ordered (Volker)
• Hybridomas (ask Kleinschmidt)
• three possibilities of titer measurement 1)qPCR 2) 3)
• make differences between HEK-293 cells compared to HEK-293T, AAV-293 cells (which contains E4 stably transfected)
• what exactly have been changed in the HEK-293 cells from Stratagene??
• four transfections have been done
• preparation of viral stocks after two days
• transfection of pAAV_mVenus_YFP
• YFP production
• problem: 4 plates with different plasmid clones (P38 and P39). P39 = sequenced cloned did not produce YFP molecules, P38 was not sequenced but YFP prodction could be seen.
• question (Kristian): no YFP production while transfection????
• possible solutions (practical control): just transfect plasmids in normal HEK-293 cells which do not contain stable transfected
• second transfection have been performed (six transfections)
• 10 µg DNA
• 30 µg DNA
• contamination is likely --> sterile filtration
• sterile filtration could lead to loss of viral material

General

• order genes (takes lot of time) is important in this stage!!!!!
  • order CAP protein
  • CD (size??)
• working sterile will be very important in the future!!
• Viral stock preparation: different protocols in the literature, which is the appropriate one we can use for our experiments?
  • possible solutions: align protocols and compare variations!
• some people need to handle changing the tropsim of the virus
• sterile filtration in cellculture
• in order to prevent contamination: other/additional antibiotic

Sponsoring

• Absage Europa-Park
• Sponsoring-Team is going to call the companies next week (important)
• Qiagen in Bio3: Kristian and Anissa are going to talk with Qiagen today

Ideas

• VEGF and EGFR could be possible targets
• Adapter-approach: Peptide in virus shell and couple to bispecific antibody
• Linker-Bibliothek--> Optimierung: Linker welcher dann nach außen schaut
• CAP Modifizierung:
  • VP3 in trans exprimieren mit gleichem Promoter
  • Mosaic viral capsid approach

Outlook

• Order genes for BioBrick Design
  • wtITRs
  • “recombinant“ ITR
• integration of viral DNA into host Genome?
• possible solution: primers which bind specifically to chromosome 19 - integration site

iGEM – Meeting 01.07.2010

Adrian presentation:
beta-globin

• generally known: Transgene expression is enhanced.
  • binding transcription factors (transcriptional effects)
  • efficient splicing (translational effects)
  • nuclear export of mRNA to cytosol (posttransaltional efects)
• assumption: sequence of 3´ and 5´ends are not conserved and necessary for function of beta globin intron (shorter beta globin introns have been found)
• Plan: design secon intron, order ITRs (wt and Stratagene)

CMV:

• BioBrick from Slovenia is wrong --> find error and correct it

ideas:

• Schnelltest für Viren; qPCR bisher einzige Möglichkeit
• cellfree culture medium or defined FCS
• Incubation of viruses with fluorescent dye
• incubation of viruses with antibody against the virus surface

pictures of fluoresence (see lab journal)

• Volker presumes that viruses are not ony i supernatant but as well in the cell pellet after centrifugation
• try ]Dichtezentrifugation“?

suicide enzymes

• order prodrug
• GMK/TK in iGEM standard
• Mr Gene: set up fee and limited bases??? (This year: NO!!! Citation: In contrast to last year there is no more length restriction or minimum volume constraint. If you have any questions, please don’t hesitate to contact Mr. Gene directly.

Good luck to all iGEM 2010 participants!Your GENEART and Mr. Gene teams)

• Genescript/ATG/DNA 2.0 sponsoring??

Sponsoring:

• DAAD
• Böhringer
• Tschira
• Sigma
• René has a list of companies including responsible persons
• DFG: reisemittel (Kira)

Cap:

• HSPG motif
• restriction sites in 585 (Volker)
• N-terminal fusion to VP3 and express in trans
• integration possible??
• regulate trans expression by
  • titration of plasmids and
  • promoter strength

OUTLOOK:

• Design and order genes
• Optimize YFP production
• cytosine deaminase (Kira) send request
• presentation in october in bioss seminar (Reth showed up in kitchen)
• order chemical which inhibits proteasomal degradation (Adri)

Source: http://www.geneart.com/index.php?id=284

iGEM Meeting 08.07.2010

Sponsoring (Kerstin, Anna, Anissa)

• Liste im wiki wurde vervollständigt
• DAAD wird von Kerstin ausgefüllt
  • Antragsformular im Internet zu finden, Kristian muss Kerstin als Projektassistenz angeben
  • Finanzplan wird von Melanie erstellt
  • aktive Beiträge der Teilnehmer
  • Zeitplan, Kontaktnachweis
  • Abschlussbericht
  • Wichtig --> Nächste Woche erledigen!!
• DFG wurde angerufen (Kira) hat Frau Schneider erreicht --> nicht für uns relevant, sondern nur für Doktoranden
• Deutsche Krebsforschung wurde angeschrieben, Telefonnummer von Kontaktperson erhalten
• Böhringer-Ingelheim: Mitte August kümmert er sich darum (wir d im August nochmals noch von Anna kontaktiert)
• GE Healthcare: Kontaktperson diese Woche nicht da
• Tschira-Foundation: Brief soll unterwegs sein, aber vermutlich Absage
• SigmaAldrich (Email wurde versandt --> Kerstin)- und Stratagene (Multi-Kit QuikChange --> Anissa) werden kontaktiert
• Hiss Diagnostics Kontaktperson kommt nächste Woche vorbei
• Renes Liste: einige potentielle Sponsoren werden angerufen
• Novartis Deutschland (Anna) wird angerufen
• Bioinformatik-Team --> Fabian:
  • SAP
  • Microsoft
  • Apple, Dell
• Wissenschaftliche Gesellschaft: Melanie  anrufen
• AOK (Kira) Ansprechpartner
• Badenova (Kira) Ansprechpartner vorhanden  Rücksprache mit Sponsoring-Team^
• DRK wird nochmal angerufen (Jessica)

FAZIT: Viele Absagen, andere Firmen werden kontaktiert
Presentation (Achim, Jessica) Media:Freiburg10_Laboratory-update_JessicaAchim.pdf‎

• 2nd Transduction more effiecient, measurement of transduction by FACS on sunday
• qPCR no protocol was performed by Chris and Hanna  no protocol in the wiki (could you fill it in??)
  • when qPCR finally work --> problem: qPCR signal even in the negative control
• 3rd transduction: forgot to add H-DMEM
  • possible reason that cells died

BioBricks:

• several approaches: gene synthesis vs ordering oligos
• ITR strategy performed by Hanna
• CAP: modifications
  • problem: five restriction sites which are in iGEM standard located near each other
  • solution: order part of gene (500 bp) and insert back into CAP, additionally: insert single cutter enzymes
  • idea: insert cloning sites into loop: 453 site, single cutters found by computer program
  • single cutter: two principles  must not change aa sequence and cut only one in whole plasmid
  • order oligos and insert them by cloning between single cutter sites
  • Major integration site (585/588): problem: mutate these sites problem: single cutter EagI after these sites, still: single cutter upstream of 585/588
  • BioBricks of DKFZ:
    • VP 1-3
    • Rep 1-4
• Sequencing
  • P42 (pAAV_RFC25) was successful
  • GOI (pAAV_mVenus_YFP) looks like there is an insertion (Hanna??)
• ITRs (aaargh ;-) )
  • PCR with overhanging primers which included the restriction sites
  • still: PCR do not work at all (even with new polymerase, different temperature, DMSO concentration, MgSO4 concentration)
  • attach ITRs to other gene synthesis (save money  no additional set up fee)
  • Hannas fancy idea: oligos have been ordered ) strategy in presentation
• beta-globin intron --> BioBrick by PCR (Hanna)
• hGH  BioBrick by PCR (Hanna)
• gmk/tk30: order tk30 and sr39 (part of gene) (Bea) Media:Freiburg10_Gene_synthesis_vs_order_oligos_07_07_2010.pdf‎

Coments:

• Communication must be improved!!!
• Documentation on wiki and lab round (10:30 a.m. meeting 15 minutes in the morning by having a coffee  good idea)
• start discussion on how the official wiki is handled and documentated, labjournal not very good!!! Improve it!! Documentate it!!!!!!
• ```Who´s going to do the wiki??``` Fabian?? Achim and Chris are thinking about it ;-) search for experienced person?
• all have to get to know the software, ask the more experienced persons
• Adrian presents his general plan for cell culture ;-)
• remember: there should be no more than two iGEMS in the cell culture room!
• Patrick und Chris voting for Saturdays and Sundays in cell culture! ;-)
• tumor-specific promoter: hTERT (Kira sent it to sequencing)
• idea: everybody has one plasmid/subproject which needs to be conducted from beginning to end
• one box – one BioBrick

iGEM Meeting 22.07.2010

Bild der Wissenschaft-Artikel ist überarbeitet worden und jetzt so in Ordnung. Eventuell werden noch Fotos gebraucht.

Logo: Das Logo ist fertig und soll so auch aufs Shirt. Farbe vom Shirt muss noch geklärt werden.

Sponsoring: Wir haben eine Absage von der AOK erhalten.

Kooperation: Wir brauchen Kooperationen für das Gold-Kriterium. Tobi hat eine Mail zu den Schweden geschickt.

Die ersten Wikis sind online.

Jessica schreibt nochmal Nano und Spiegel an.

Lab:
Volker will send our project status and plan to different people who work with AAV and hopes to get response and critique about our project.
Antibodies will be needed. Buying or asking (Kleinschmidt, DKFZ)?

EGF-receptor:
Increased EGFR-expression reduces AAV2 transduction through phosphorilation of Tyrosin730 which leads to ubiquitous degradation.

We got unpublished biobricks from the 2009iGEM team which could be sent to Boston this year.

Different linkers which carry the possibility to be detected (column, antibody) could be cloned to VP1-3 constructs to determine which parts on the VP are exposed to the outside.

cell culture:
first FACS data evaluated
two percentages:
-first  % of YFP expressing cells related to living cells
-second % of living cells
It was tested whether it makes a difference It could be shown that the viruses are in the pallet, not in the supernatant
qPCR should be done from plasmid and supernatant.
Could the viruses be stained in a simple way?
In contrast to Stratagene-protocol it is not necessary to use 30µg plasmid. 10µg are sufficient.
Test: Is amount of Gene of Interest related to YFP-expression?-difficult to evaluate at the moment
Cell densitiy is important for efficency of transfection.
If cells are prepered from cells, there is no need for serum-free essays.
Prototol for FACS should be changed

For digestion: We have a new BSA (100x) stock, check concentrations!
Hanna: ITRs have a prefix, sequencing of ITR region doesn't work due to strong secondary structures (same reason why our site-directed mutagenesis PCRs didn't work). But the method is working.
Electronmicoscopy course (Golecki 36th week): Own samples can be used.
Purification via column or antibodies? Is it possible to get the column sponsored.
New computers: Sven and Chris set up two new computers.

Sven: we got all RFC25 constructs and other buffers, ligases.
Check that you put everything where it belongs (4°C, -20°C, -80°C,...) if it is not needed anymore.
We are running out of time. Coordination in lab should be improved. Finish your work.
Show other people in the lab what you are doing, there will be too much work soon enough!
In lab journal specify what you are doing and with what intentions in the title.
Watch for sterility!

iGEM Meeting 29.07.2010

1. Lab-Update presented by Anissa, Kerstin and Anna:

BioBrick production:

• Insertion of hGH and beta-globin into pSB1C3 didn’t work (Cerulean is still in the plasmid); repetition of PCR and cloning is in work.
• His-Tag insertion: Question of Toby: Why His-Tag? It’s nothing new.. BioBrick exists.
• GMK_TK30 was cloned into pAAV_RFC25; still contains 3 iGEM restriction sites, which need to be removed.
• Side directed mutagenesis: pAAV_RC: PstI 310 & 4073 were removed; BamH and 1239 SDM already done, to do: picking clones.
• pKex_VP1-3: removal of PstI (4073) done
• linkers from Gerrit: sequenced
• split linker: no linker but YFP in plasmid
• strep linker: suffix with 2 AgeI restriction sites -> digest with AgeI next time!
• Remaining linker: sequencing was successful

Cell culture:

• Transfection with different consentrations (18 µg and 24 µg)
• Transduction..
• FACS:
  • ~ 90% of HT1080 natice cells ]survived”
  • 16 % YFP positive cells of 60% living cells
  • Remark by Volker: Exclusion of dead cells (30%) could be problematic for the statistics… are they dead due to virus infection?
• Different transduction methods: 300 µL dropped, 600 µL dropped, 300 µL resuspended, 600 µL resusoended, 450 µL resuspended of 18 µg or 24 µg plasmid-transfection -> nearly no difference between the YFP positive cells… more virus does not mean a better transduction? Be careful with conclusions (Kristian).

hTERT promoter: convertion into RFC10 standard needs to be done.

Targeting:

• Affibodies: ordered.
• Darpins: 3 darpins… find out, which one is the best!

Lab Journal:

• Informative and clear headline + short introduction and aim of experiment (comments) under the headline + investigator name
• iGEM wiki: HTML code!
• Document results, gel pictures, sequencing data!
• Official wiki needs to be ]aufgemotzt!” (Kristian)
• To do: Wiki aufräumen
• Suggestion: Summarize experiments and results separately from procedure page (Volker)
• Upload presentations! (Kristian)

2. Construction manual for the virus kit needs to be done. (Takes a lot of time (Volker)).
3. Cytosindeaminase: Vector will arrive next week, 2 restriction sites must be removed, primers have been designed. (Kira)
4. Loop integration:

• RGD motif -> Targeting of integrines
• His-Tag -> Binding to IMAC (Column)
• Combination of loop integration for purification and fusion of targeting molecule to N-terminus
  • +++/--- loaded molecules
  • Z34C -> Binding to IgG
  • BAP (15 AS)
  • BirA -> Biotinylation -> Binding of Strepavidin, Avidin, gold particles, avidin-fused fluorophore, … for purification or imaging

5. ITRs: right ITR is in RFC10 standard (needs to be validated with test digestion and sequencing), left ITR needs 2 further cloning procedures.
6. General stuff: Shirts:

• Probably no Hugo Boss Shirts
• other shirts need to be ordered (Volker)
• Suggestion Jessy: Carhartt? Anna asks at the outlet in Weil am Rhein.
• Local print company: Take shirts from them? Advantage: sizes can be checked.
• Fabi: Print machine at SC?
• Very loooong discussion…. :)

Attendance sheet: Fill in, when you’re planning to be present and when not! Important for planning!

Kristian will be on holiday for 3 weeks!

BIOSS meetings take place every Tuesday. We should also present our project there.

Preparation of presentation for virology in order to get feedback (Peter Stäheli etc.) and support should be done. (Volker) Suggestion Kristian: Perhaps it would be better to talk to them ]in frame of a kaffeeklatsch” (Zitat: Jessy) :)

Sponsoring: DAAD application for software team needs to be done, NEB sponsoring must be done!

Next presentation: Stefan and Kira in 2 weeks; Johannes and Chrisian L. in 4 weeks

iGEM Meeting 05.08.2010

1. Fabian gave a short introduction in html-code; for finding any description, type ]html and command (e.g. color) in google

2. Labupdate

* Kira: SDM of Rep 68 and Rep 78 was succesful
* Patrick: ITRs (left and right) was cloned into pSB1C3
* Volker: Biobricks of Rep68/78, Rep40/52 and AAP (SDM of Rep40/52 wasn't succesful); Oligos for loop will be ordered
* Chris: MiniPreps of pSB1C3_mGMK
* Stefan: BioBrick production of pSB1C3_mGMK
* Jessica: Three linker were cloned into pSB1C3; SDM of SspI and PuvII (sequencing result showed, that SDM was succesful)
* Bea: BioBrick production: pSB1C3_hgH/beta-globin/CMV/ITRs/GMK production was succesful. Next steps: constructs have to be cloned together
* Hanna: Ordering of Affibody: ZEGFR:1907 and ordering of p5 primer

* pSB1C3 backbone has mutations
* normal ligations (without blunt ends) should be done with T4 ligase instead of Quickligase

iGEM Meeting 12.08.2010

Presentation of Kira and Stefan: http://www.molbiotech.uni-freiburg.de/iGEM/wiki2010/images/b/bb/Lap_talk_120810.pdf

Sven said that if we´ve sequenzed the parts we should prep them and save them savely in the fridge

There´s a new plan for SspI and PuvII: SDM of SspI and SDM of PuvII, clone together with other enzymes, check sequencing.
Cooperation with Heidelberg? They are working as well with AAV -> E-Mail
Strassbourg will visit us and present their project. We should present our project to them as well
Update t-shirts of Jessica and Anna.
Sponsering update Anna
Chris W. mentioned that from the 1th of september 2010 we have to pay 14,99 Dollar with a credit card to get a Visa. Jessica said that we should pay the money to the the tourist agency and they should use their credit card to pay for us.
Homepage update, Chris W. will meet up with Fabi on a regular basis
antibiotics should be refilled early enough
site directed kit is available
Sven wants us to a inventory for stocks
Excel sheets should be labeled reasonable. For example sequencing (what?, who?), name of the person who sent the sample to the sequencing, date. In addition apply a folder where the sequencings are filed in.

Labupdate

* New wiki navigation button ]Cellculture“ established.
* A431 cells very aggressive. At the digestion (usully max. 120 sec.) after 10 minutes still not dead.
* At the FACs analysis lots of dead cells (70 % alive). If you take colder PBS, 25 minutes instead of 40 minutes in the water bath, 90 % of the cells alive -> BUT: the YFP expression is worse

iGEM Meeting 09.09.2010

1. Travel planning:
Application form (p80) has to be filled out until Monday, 13th
Anissa and Anna will visit the ]Reisekostenstelle“ to get general information about the possible duration of the stay.

2. Cloning advances:

• Viral Bricks for loop insertions:
  

Recent update: 10 of the 14 Viral bricks are ready to use, the remaining Z34C constructs are in production.
Because the oligos for these constructs are quite too long, they had to be filled up by the Klenow enzyme. The first reactions didn't work because of several circumstances: Reasons could be that the heat inactivation wasn't done or the iGEM restriction enzymes weren't active in the Klenow buffer.

• N-terminal fusion:
  

Darpin production isn't finished until the 17th, so there is the question of ordering the express variant.

• Rep/Cap insertion:
  

Unfortunately, Rep insertion didn't functionate. Cloning of Cap is in progress, but wasn't tested yet.

• Cytosine Deaminase:
  

First Ligation of insert and vector failed, maybe because the Quick Ligase Buffer was too old. Another approach will be done with T4 Ligase.
According to that, there is the idea to generate TK/CD as a fusion protein, but it has to be checked which linnker must be used.

3. Cell culture:
Re-Transfection of Rep (synthetic variant) with old 293 cells was done again, went wrong. New cells were freezed up and will be ready to use in 1-2 days.
New transfection of old 293 cells with TK/GMK constructs will help to make a conclusion about the calculation of optimal ganciclovir concentration.

4. Wiki:
From MONDAY, 13th: Start editing in new wiki on MIT server!!!
Labjournal of July to September must be equalized, images uploads are in progress.
Group decision: All labdays are underlined in green.

5. Modelling:
We are still searching for someone to work on modelling.