Template:KIT-Kyoto-Augsut27
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+ | :: ↓抽出液を捨てた | ||
+ | :: ↓遠心30秒(20℃、14500rpm) | ||
+ | :: ↓抽出液を捨てた | ||
+ | :: ↓滅菌水をカラムに入れた | ||
+ | :: ↓遠心30秒(20℃、14500rpm) | ||
+ | :: ↓溶出液を回収 | ||
+ | :: ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた | ||
+ | :: ↓遠心10分(4℃、14000rpm) | ||
+ | :: ↓上清をすて、70%エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた | ||
+ | :: ↓遠心5分(4℃、14000rpm) | ||
+ | :: ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥 | ||
+ | :: ↓MilliQを30μl加えた | ||
+ | :: ↓二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した | ||
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+ | :: Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した | ||
+ | :: (マーカーは1kbp radderを使用した) | ||
+ | :: ↓100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色 | ||
+ | :: ↓泳動結果を写真で撮影した | ||
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+ | :(2) エチジウムブロマイドの作成 | ||
+ | ::MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液(0.44mg/mL)を1滴加えた | ||
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+ | '''Results''' | ||
+ | :(1) 十分に濃いバンドが確認できた | ||
+ | ::これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる | ||
+ | :(2) 1滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに3滴付加したところ十分に使用できるようになった | ||
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+ | :(1) 次回からは100倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき | ||
+ | :(2) これより40mL分を作る時は少なくとも4滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる |
Latest revision as of 11:26, 25 October 2010
August 27
Time
- 9:00~
Member
- 福山,竹内,臼井
- Fukuyama,Takeuchi,Usui
Purpose
- DNA miniprep of psB6A1(K121013).[Takeuchi]
- Making of EtBr.[Takeuchi]
- (1) psB6A1(K121013)のミニプレ [竹内]
- (2) エチジウムブロマイドの作成 [竹内]
Method
- (1) psB6A1(K121013)のミニプレ
- psB6A1(K121013)24mL分を分注した
- ↓遠心1分(20℃、14500rpm)して集菌し、エッペン2本分にした
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μl加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14500rpm)
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分(20℃、14500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
- ↓溶出液を回収
- ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
- ↓遠心10分(4℃、14000rpm)
- ↓上清をすて、70%エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
- ↓遠心5分(4℃、14000rpm)
- ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
- ↓MilliQを30μl加えた
- ↓二本分のまとめ、そのうち6μLを電気泳動に使用した
- Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
- (マーカーは1kbp radderを使用した)
- ↓100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
- ↓泳動結果を写真で撮影した
- (2) エチジウムブロマイドの作成
- MilliQを40mLに臭化エチジウムブロマイド溶液(0.44mg/mL)を1滴加えた
Results
- (1) 十分に濃いバンドが確認できた
- これより、ミニプレによるプラスミド抽出は成功したと考えられる
- (2) 1滴では十分な染色が行えなかったので、後日さらに3滴付加したところ十分に使用できるようになった
Consideration
- (1) 次回からは100倍希釈による吸光度測定を行い、プラスミド濃度を測るべき
- (2) これより40mL分を作る時は少なくとも4滴は加えた方が使用に十分な染色液が作れると考えられる