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From 2010.igem.org

August 16

Time

9:00～17:00

Member

岩城,福山,竹内,臼井,足立,中村,革島

Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Adachi,Nakamura,Kawashima

Purpose

1. Cuitivate pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450) for recovery of plasmids.[Usui,Nakamura,Adachi]
2. Transform pSB1A2(E0240) into the competent cells(DH5 Alpha).[Usui,Nakamura]
3. Design primers for using PCR.[Iwaki,Takeuchi]

(1)　プラスミドを大量に回収するためにpSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を培養する　[臼井、中村、足立]

(2)　目的のインサートを持たないpSB1A2(J44000)を増やしていたため、

pSB1A2(E0240)をトランスフォーメーションしなおす

また、パーツ登録時に必要なpSB1C3(J04450)のトランスフォーメーションをする　[臼井、中村]

(3)過酸化水素応答プロモーターをPCR処理によって得るためのプライマーを設計する　[岩城、竹内]

Method

(1)　pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)の培養

　プレート培地上のコロニーからpSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)をピックアップし、

　各2本ずつ、それぞれYT培地30ml(+kan)・YT培地30ml(+amp)を使用し、37℃,overnightで振とう培養した

(2)　pSB1A2(E0240)及びpSB1C3(J04450)のトランスフォーメーション

　DH5αを on ice 10分

　↓pSB1A2(12-M)及びpSB1C3(3-A)をそれぞれ1μLずつ加え、on ice 30min.

　↓42℃で45秒間ヒートショックを行った

　↓on ice 2min.

　↓37℃に温めたSOC培地0.9mLを加え、37℃シェーカーで1時間振とう培養を行った

　↓培養した菌液全量をプレートにまいた

　↓37℃でインキュベートした(Overnight)

(3)　プライマーの設計

過酸化水素応答プロモーター配列をiGEM推奨のサイトGinkgo Bioworksを用いて編集し、プライマーを設計した

Results

(1)　プラスミドを抽出するのに十分な増殖が肉眼で確認できた

(2)　コロニーが生育した

(3)　後日、AcrABはPCR処理で上手く得ることができたが、

SodA,ProxyRに関してはPCR処理でうまく得ることができなかった

Consideration

(1)　翌日、プラスミド抽出を行う

(2)　翌日、シングルコロニーピックアップを行う

(3)　プライマー設計時に何かしらの間違いがあったものと考えられるが詳細はいまだ不明