Template:KIT-Kyoto-Augsut26

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Revision as of 11:15, 3 October 2010

August 26

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Time

9:00～

Member

岩城,竹内,中村,臼井,足立

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Adachi

Purpose

(1)　大腸菌の生存曲線を調べ(2日目)、生存曲線を作成　[足立]

(2)　前日にアルカリミニプレップしたpSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)を制限酵素で処理、処理の確認(電気泳動)　[臼井]

(3)　SodAのプロモーターをPCRによって増幅　[臼井]

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる

　前日まいたコロニーの数を数え、今までのデータを統計、生存曲線を作成した

(2)　pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)の制限酵素処理

　右表の組成で制限酵素処理を行い、37℃で1時間インキュベートした
　↓電気泳動を以下の方法で行った
　　　　1×ladderをマーカーとし、一番左のコームに流した
　　　　↓Loading Buffer1μLに対し
　　　　　pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005),pSB1A2(I13507)をぞれぞれ5μLの割合で加え左から
　　　　　2∼4番目にpSB1A2(E0430)、
　　　　　5~7番目にpSB1A2(J22005)、
　　　　　8番目(右端)にpSB1A2(I13507)をそれぞれコームに流した

　↓結果を写真撮影した

＜組成＞
EcoRⅠ	lμL
PstⅠ	1μL
プラスミドDNA	5μL
10×H Buffer	2μL
H₂O	11μL
全量	20μL

(3)　SodAのPCR処理

下表の組成でテンプレートDNAにDH5αを使用したものを2本(DH5α-1,DH5α-2)、
JM109を使用したものを2本(JM109-1,JM109-2)作製した
↓以下のプログラムでPCR処理を行った

＜PCR試薬の組成＞
	SodA
PrimerF	1.5μL
PrimerR	1.5μL
dNTPs	5μL
KOD-Plus- Buffer	5μL
テンプレートDNA (DH5α,JM109)	0.5μL
MgSO₄	4μL
H₂O	31.5μL
KOD-Plus-	1μL
total	50μL

Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
94℃	94℃	62.2℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	保持
	30サイクル

Results

(1)　計測した結果を以下にまとめた

[H₂O₂]	0mM	1nM	10nM	100nM	1μM	10μM	100μM	1mM	10mM	100mM
コロニー数	231	220	165	133	109	80	31	1	0	0

これを元に、大腸菌の生存曲線を作成した

以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断した

図17Bは、大腸菌XL-ブルーおよびO-112a,c血清型の生存能力に対するH₂O₂の濃度依存的毒性を示す

<引用文献>
　桂川国際特許事務所
「抗体または好中球を介するオゾン生成」

(2)　pSB1A2(E0430)はすべてバンドが見えたので、

バンドの一番濃かった左から4番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)

pSB1A2(J22005)は左から6番目と7番目がバンドが見えたので、

7番目のものを3mLのLB培地(amp+)で37℃で振とう培養した(overnight)

RFP(I13507)はバンドが現れなかった

(3)　PCR処理を行った4つ全てについてSodAが十分量含まれていることが27日(金)の電気泳動によりわかった

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 == August 26 ==
+<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 '''Time'''
 :9:00～
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 ::<TD>＜組成＞</TD></TR>
 ::<TR>
-::<TD>EcoRⅠ</TD><TD>lμL</TD></TR>
+::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>lμL</TD></TR>
 ::<TR>
-::<TD>PstⅠ</TD><TD>1μL</TD></TR>
+::<TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>1μL</TD></TR>
 ::<TR>
 ::<TD>プラスミドDNA</TD><TD>5μL</TD></TR>
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 ::<TD>10×H Buffer</TD><TD>2μL</TD></TR>
 ::<TR>
-::<TD>H2O</TD><TD>11μL</TD></TR>
+::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>11μL</TD></TR>
 ::<TR>
 ::<TD>全量</TD><TD>20μL</TD></TR>
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 ::<TD>テンプレートDNA<BR>(DH5α,JM109)</TD><TD>0.5μL</TD></TR>
 ::<TR>
-::<TD>MgSO4</TD><TD>4μL</TD></TR>
+::<TD>MgSO<SUB>4</SUB></TD><TD>4μL</TD></TR>
 ::<TR>
-::<TD>H2O</TD><TD>31.5μL</TD></TR>
+::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>31.5μL</TD></TR>
 ::<TR>
 ::<TD>KOD-Plus-</TD><TD>1μL</TD></TR>
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 :(1)　計測した結果を以下にまとめた
 ::<TABLE BORDER="1"><TR>
-::<TD>[H2O2]</TD><TD>0mM</TD><TD>1nM</TD><TD>10nM</TD><TD>100nM</TD><TD>1μM</TD><TD>10μM</TD><TD>100μM</TD><TD>1mM</TD><TD>10mM</TD><TD>100mM</TD></TR>
+::<TD>[H<SUB>2</SUB>O<SUB>2</SUB>]</TD><TD>0mM</TD><TD>1nM</TD><TD>10nM</TD><TD>100nM</TD><TD>1μM</TD><TD>10μM</TD><TD>100μM</TD><TD>1mM</TD><TD>10mM</TD><TD>100mM</TD></TR>
 ::<TR>
 ::<TD>コロニー数</TD><TD>231</TD><TD>220</TD><TD>165</TD><TD>133</TD><TD>109</TD><TD>80</TD><TD>31</TD><TD>1</TD><TD>0</TD><TD>0</TD></TR></TABLE>